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ESTRATEGIA DE PROPAGACIÓN in vitro DE Aechmea fasciata PARA LA REGENERACIÓN DE PLANTAS COMPLETAS. Previa a la obtención de Grado Académico o Título de:

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1 ESTRATEGIA DE PROPAGACIÓN in vitro DE Aechmea fasciata PARA LA REGENERACIÓN DE PLANTAS COMPLETAS. Previa a la obtención de Grado Académico o Título de: INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA R. Valeria Vallejo T. Directora: M. Sc. Mónica Jadán Codirector: Ing. Pedro Romero

2 Introducción BROMELIAS Plantas monocotiledóneas originarias del continente americano. Incluye 56 géneros, especies y subespecies, más de la mitad son epífitas. En Ecuador, la única cultivada es la piña, con aproximadamente 600 Ha. Tillandsia dyeriana se encuentra en los manglares Llamadas también huaicundos Proveen de un sitio para vivir a insectos, ácaros, crustáceos, moluscos e incluso pequeños anfibios.

3 Formulación del problema Justificación Tala indiscriminada de bosques. Pérdida de especies endémicas. Crecimiento lento Propagación in vitro: Mayor número de plantas en menor tiempo. Plantaciones uniformes. Plantas sin microorganismos. Interés económico

4 General Establecer una estrategia de propagación in vitro de Aechmea fasciata para la regeneración de plantas completas. Específicos Determinar el protocolo de desinfección más adecuado para la introducción de explantes de Aechmea fasciata. Establecer la dosis óptima de reguladores de crecimiento en la fase de introducción que permita la adaptación de los explantes. Determinar la dosis óptima de BAP, corte del explante y consistencia del medio en la fase de multiplicación que permitan obtener el mayor número de brotes. Estudiar el efecto de dos auxinas en la fase de enraizamiento, que permitan la obtención del mayor número de plantas enraizadas. Determinar la estrategia más económica para la regeneración de Aechmea fasciata in vitro.Objetivos

5 Marco teórico Aechmea fasciata 140 especies distribuidas desde México hacia Sudamérica. Se presenta como roseta de largas hojas, márgenes aserrados, inflorescencia en espiga. Planta ornamental. Las hojas están cubiertas de tricomas. En Ecuador existen 447 especies, incluyendo 152 especies endémicas, agrupadas en 13 géneros (Manzanares 2000, Valencia & León Yánez 2002). Muestran gran adaptabilidad y resistencia a condiciones ambientales extremas (Miranda et al. 2007). El ciclo de vida abarca de 2 a 30 años. Morfologías: Plantas terrestres (Ananas, Pitcairnia) Plantas epifitas con reserva de agua (Neoregelia, Aechmea) Plantas epifitas sin tanque (Tillansia recurvata, T. circinata)

6 Cultivo in vitro de tejidos vegetales Cultivar plantas dentro de un frasco de vidrio en un ambiente artificial. Características fundamentales: la asepsia y el control de los factores que afectan el crecimiento. Medio de cultivo 1. Macroelementos y microelementos C,H,P,K,S,Ca,Mg – B,Zn,Mn,Fe,Cl 2. Reguladores de crecimiento. - Auxinas Agrandamiento y alargamiento celular, formación de raíces laterales y adventicias, retardo en la abscisión de hojas y frutos, entre otros efectos. - Citoquinas El proceso de división celular, la diferenciación en tejidos vegetales, la modificación de la dominancia apical y diferenciación de tallos. 3. Agentes gelatinizadores Agarosa y agaropectina. 4. Fuente de carbono Sacarosa 5. Vitaminas Tiamina, piridoxina, ác. nicotínico, mioinositol 6. Factores físicos Temperatura, luz, pH

7 Propagación in vitro de Aechmea fasciata Etapa 0:Selección de la planta donadora y preparación. Etapa 1:Establecimiento del medio de cultivo in vitro. Etapa 2:Multiplicación. Etapa 3:Enraizamiento. Etapa 4: Aclimatación de las plántulas.

8 Materiales y métodos La investigación se realizó en los Laboratorios de Servicios Agrobiotecnológicos AGROBIOTECH, ubicados en la Provincia de Pichincha, Cantón Rumiñahui. El material vegetal utilizado fueron hijuelos de Aechmea fasciata proporcionado en el laboratorio.

9 Fase de desinfección Tratamiento Concentración Cloro (%) Tiempo (min) T10.53 T20,55 T30,753 T T513 T615 Variables a evaluar: Contaminación (fúngica y bacteriana) Fenolización Mortalidad A.Explantes sumergidos en ácido cítrico hasta su siembra. B.Explantes listos para la desinfección en cámara. C.Explantes que serán introducidos en el medio de cultivo. D.Explantes sembrados. Metodología: Tratamientos aplicados para la desinfección de explantes.

10 Fase de introducción TratamientoANA (mg/L)AIA (mg/L)AIB (mg/L) , Variables a evaluar: Adaptabilidad. Contaminación (fúngica y bacteriana). Longitud del explante. A)Brote de A. fasciata a los empezando la fase. B)Brote de A. fasciata a los 20 días de la fase. C)Brote de A. fasciata lista para la siguiente fase. Metodología: Tratamientos aplicados para la fase de introducción de explantes.

11 Fase de multiplicación Tratamiento Dosis de BAP (ppm) Tipo de corte del explante Consistencia del medio T10,0LongitudinalLíquido T21,0LongitudinalLíquido T32,0LongitudinalLíquido T40,0LongitudinalSemisólido T51,0LongitudinalSemisólido T62,0LongitudinalSemisólido T70,0 Longitudinal y ruptura de dominancia apical Líquido T81,0 Longitudinal y ruptura de dominancia apical Líquido T92,0 Longitudinal y ruptura de dominancia apical Líquido T100,0 Longitudinal y ruptura de dominancia apical Semisólido T111,0 Longitudinal y ruptura de dominancia apical Semisólido T122,0 Longitudinal y ruptura de dominancia apical Semisólido Presencia de brotes Longitud del explante Contaminación A)Explante listo para ser cortado. B)Explantes con corte longitudinal. C)Explante sembrado en medio semisólido. D)Explantes sembrados en medio líquido. E) Explantes multiplicados. Tratamientos aplicados para la fase de multiplicación de explantes. Variables a evaluar:

12 Fase de enraizamiento Tratamiento Dosis de AIB (ppm) Dosis de AIA (ppm) T10,0 T20,50,0 T31,00,0 T40,00,5 T50,5 T61,00,5 T70,01,0 T80,51,0 T91,0 Variables a evaluar: Longitud de la raíz. Altura del explante. Color del explante. A)Explante con nuevos brotes. B)Brotes separados del explante principal. C)Explantes sembrados en el medio de enraizamiento. D)Explantes sembrados en los 9 tratamientos. E)Explantes con raíces. Tratamientos aplicados para la fase de enraizamiento de explantes.

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14 Etapa de Desinfección: Contaminación del explante ContaminaciónexplanteContaminaciónexplante Figura 1. Gráfico de porcentaje de contaminación utilizando los 6 tratamientos de NaClO. Figura 2. Gráfica de frecuencias de explantes no contaminados respecto a la concentración de hipoclorito de sodio. Figura 3. Gráfica de frecuencias de explantes no contaminados respecto al tiempo de inmersión T5: 1% NaCl – 3min T6: 1% NaCl – 5min

15 ExplantesExplantes Contaminados

16 PruebasPruebas microbiológicas Fotografía de la prueba KOH para la fase de desinfección. Fotografías de antibiogramas realizados para la fase de desinfección.

17 Tabla 1. Prueba de Friedman para la variable contaminación. Tabla 2. Prueba de Kruskal-Wallis para la variable contaminación (28 días). Análisis estadístico

18 Etapa de Desinfección - Fenolización Figura 4.Gráfico de porcentaje de fenolización después de la aplicación de los tratamientos de NaClO. Al realizar las pruebas estadísticas no se encontró diferencia significativa p = 53% T2: 0,5% NaCl – 5min T3: 0,75% NaCl – 3min T5: 1% NaCl – 3min T6: 1% NaCl – 5min

19 Etapa de Desinfección - Mortalidad Figura 5. Gráfica de frecuencias de explantes vivos respecto a la concentración de hipoclorito de sodio y tiempo de inmersión.

20 Etapa de Establecimiento - Adaptabilidad Figura 6. Gráfica de frecuencias de explantes adaptados según los tratamientos utilizados. Al realizar las pruebas estadísticas no se encontró diferencia significativa p = 64%

21 Etapa de Establecimiento – Longitud del Explante Longitud Tratamiento AA Promedio de longitudes 10,46 20,5 30,41 40,40 50,71 60,46 70,50 80,46 Tabla 3. Promedio de longitudes de los explantes a partir de los tratamientos utilizados. Figura 7. Gráfica de frecuencias del promedio de longitudes de los explantes de Aechmea fasciata. T5: 0,1ppm ANA – 0 ppm AIA – 0 ppm AIB

22 Longitud de Explantes

23 Tabla 4. ADEVA para la longitud (cm) promedio de los explantes de Aechmea fasciata. Figura 8. Gráfica de perfil de la concentración de ANA y la concentración de AIA. Figura 9. Gráfica de perfil de la concentración de ANA y la concentración de AIB. Análisis estadístico p = 1,9%

24 Etapa de multiplicación – Número de brotes Número Figura 10. Gráfico de cajas mostrando las medias del número de brotes respecto a los 12 tratamientos. Tabla 5. Número de brotes según el tratamiento. T7: : 0ppm BAP – corte longitudinal, apical – medio líquido Al realizar las pruebas estadísticas no se encontró diferencia significativa p = 70%

25 Explantes multiplicadosmultiplicados

26 Etapa de multiplicación – longitud de brotes Figura 11. Gráfico de cajas mostrando las medias de la longitud de explantes respecto a los 12 tratamientos. Tabla 6. Variación de longitud de brotes en centímetros T7: 0ppm BAP – corte longitudinal, apical – medio líquido

27 Tabla 7. Prueba LSD de Fisher para la interacción de BAP, tipo de corte y consistencia del medio, respecto a la longitud del explante. Etapa de multiplicación – longitud de brotes Análisis estadístico

28 Etapa de enraizamiento – Longitud de la raíz Longitud Figura 12. Gráfico de cajas mostrando la variación de longitud de las raíces respecto a los tratamientos Tabla 8. Variación de la longitud de la raíz en centímetros T6: 1ppm AIB – 0,5ppm AIA T8: 0,5ppm AIB – 1ppm AIA

29 Explantes enraizadosenraizados

30 Tabla 9. Prueba LSD de Fisher para el análisis de la interacción entre las hormonas AIA y AIB. Etapa de enraizamiento – Longitud de la raíz Figura 14. Gráfica de perfil de la concentración de AIA y la concentración de AIB. Análisis estadístico

31 Etapa de enraizamiento – Longitud del explante Figura 13. Gráfico de cajas mostrando la longitud del explante respecto a los 9 tratamientos utilizados. Tabla 10. Variación de longitud de explantes en centímetros T8: 0,5ppm AIB – 1ppm AIA

32 Tabla 11. Prueba LSD de Fisher para el análisis de la interacción entre AIA y AIB para la longitud del explante. Etapa de enraizamiento – Longitud del explante Figura 15. Gráfica de perfil de la concentración de AIA y la concentración de AIB.

33 Etapa de enraizamiento – Color del explante Escala colorimétrica establecida en por Lindsey y Brown 2006

34 Determinación de la estrategia más económica para la regeneración de plantas de Aechmea fasciata. MaterialesCantidad Costo unitario Costo total Hojas de Bisturí40,502,00 Pinzas215,0030,00 Probeta 10ml14,50 Frascos de vidrio150,253,75 Cuchillo13,00 Jeringuillas 10ml y 5ml1 caja10,00 Mandil18,00 Zapatos1 par10,00 Mascarilla20,601,20 Gorro20,601,20 Marcador de vidrio12,00 Cinta envolvente1 rollo3,50 TOTAL43,25 SuministroUnidad Consumo mensual (USD) Valor Total (7 meses) LuzkWh193,7016,8 AguaM3M3 8,0081,9 TOTAL 98,7 DetalleValor Total Material de laboratorio43,25 Suministros98,7 Total141,95 Tabla 12. Determinación del costo de los materiales de laboratorio para la micropropagación de Aechmea fasciata. Tabla 13. Determinación del costo de suministros de producción de Aechmea fasciata. Tabla 14. Determinación de los costos fijos del proyecto.

35 Determinación de costos directos por cada tratamiento en las 4 fases. Fase de desinfección Fase de introducción Descripción Precio / NaCl Insumos Maquinaria y equipos Mano de obra Costo total (USD) T10,05 18,061,945,1725,22 T20,05 18,061,945,1725,22 T30,08 18,061,945,1725,25 T40,08 18,061,945,1725,25 T50,11 18,061,945,1725,28 T60,11 18,061,945,1725,28 Descripción Precio/medio + hormonas InsumosMaquinaria Mano de obra Costo total (USD) T10,3110,51,453,7516,01 T20,3110,51,453,7516,01 T30,3110,51,453,7516,01 T40,3210,51,453,7516,02 T50,3110,51,453,7516,01 T60,3210,51,453,7516,02 T70,3110,51,453,7516,01 T80,3310,51,453,7516,03

36 Fase de multiplicación Fase de enraizamiento Descripción Medio + hormonas InsumosMaquinaria Mano de obra Costo total (USD) T10,582,16 0,9858,72 T20,592,16 0,985 8,73 T30,602,16 0,9858,74 T40,612,16 0,9858,75 T50,622,16 0,9858,76 T60,632,16 0,9858,77 T70,582,16 0,9858,72 T80,592,16 0,9858,73 T90,602,16 0,9858,74 T100,612,16 0,9858,75 T110,622,16 0,9858,76 T120,632,16 0,9858,77 Descripción Medio + hormonas InsumosMaquinaria Mano de obra Costo total (USD) T11,452,83 1,31511,59 T21,46 2,83 1,31511,60 T31.462,16 1,31511,60 T41,462,16 1,31511,60 T51,472,16 1,31511,61 T61,472,16 1,31511,61 T71,462,16 1,31511,60 T81,472,16 1,31511,61 T91,472,16 1,31511,61

37 COSTO(USD) Fase de desinfección141,95 Fase de introducción128,12 Fase de multiplicación104,94 Fase de enraizamiento104,43 TOTAL479,44 COSTO(USD) Costos fijos141,25 Costos variables479,44 TOTAL620,69 Determinación de costos directos por cada fase. Determinación del costo total de la producción de Aechmea fasciata in vitro.

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39 Una concentración de 1% de hipoclorito de sodio por un tiempo de cinco minutos de inmersión permite obtener explantes viables y libres de contaminación en el proceso de desinfección de Aechmea fasciata; es necesaria la aplicación de un antioxidante en el medio de cultivo para ayudar a que el explante no elimine fenoles de manera inmediata y pueda empezar a adaptarse al medio. Los explantes adaptados al medio de cultivo empiezan a cambiar su color, de blanco a verde conforme avance su desarrollo. La longitud del explante permitió establecer estadísticamente el mejor tratamiento de introducción debido a la diferencia significativa obtenida, donde el tratamiento adecuado fue T5 (0,1mgL -1 de ANA, 0mgL -1 de AIA y 0mgL -1 de AIB) alcanzando la mayor longitud. El mayor número de brotes en la fase de multiplicación estuvo favorecido por el tratamiento que contenía el medio con sales M&S, suplementado con 0mgL -1 de la hormona BAP.

40 La longitud del explante y el crecimiento de brotes presentan un mejor desarrollo en un medio M&S sin la adición de agar. Las concentraciones de 0,5 y 1mgL de AIA y AIB son las que favorecieron en un mayor tamaño tanto en la longitud de la raíz como en la longitud del tamaño del explante durante la fase de enraizamiento. El color de los explantes se mantuvo en el mismo tono verde, indicando el avance de su desarrollo. El uso de carbón activado provee un ambiente de oscuridad al medio de cultivo, aumentado en gran manera la generación de raíces. El método de multiplicación para Aechmea fasciata presenta un costo para el mercado de 0,76 centavos de dólar.

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42 Es importante realizar ensayos previos para encontrar el tratamiento adecuado para la desinfección de las bromelias, sin olvidar que se debe eliminar toda la humedad que puede tener la planta. Se debe tener mucho cuidado en el manejo de los explantes para no contaminarlos, así como se debe esterilizar bien los materiales, es importante cambiar las pinzas cada vez que se realice el trabajo en cámara. Es necesario para un buen desarrollo del explante mantener controladas las condiciones ambientales a las que se encuentra la planta, ya un exceso de humedad o rayos solares puede dañar el explante. Con el fin de disminuir el coeficiente de variación, se debería homogenizar el material vegetal, para que los explantes de A. fasciata que serán utilizados estén en igual condiciones. Se recomienda realizar ensayos adicionales para la conservación de este material vegetal, ya que es una especie que se encuentra en peligro de extinción.

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