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CITOQUIMICA APLICADA A LA HEMATOLOGIA Bqca. Ivan María Victoria Hematología Clínica 2011.

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1 CITOQUIMICA APLICADA A LA HEMATOLOGIA Bqca. Ivan María Victoria Hematología Clínica 2011

2 Son un complemento de las tinciones hematológicas. Por medio de ellas se localizan enzimas y sustancias inorgánicas. Así se mejora la diferenciación celular. También sirven para el diagnóstico de ciertas leucemias. La citoquímica estudia la composición química de la célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos, enzimas, metales pesados y otras sustancias. MORFOLOGÍA BIOQUÍMICA

3 CITOMORFOLOGIA % CITOQUIMICA.90-95% INMUNOFENOTIPO MICROSC. ELECTRN. MAS % CITOGENETICA Y BIOL. MOLECULAR CONFIABILIDAD DE LOS METODOS PARA EL Dx DE LAS LEUCEMIAS AGUDAS

4 Tres pasos fundamentales: Fijación: preservar las estructuras y reactividad funcional de las células. Incubación en el medio de reacción: como consecuencia se generan productos que ponen en evidencia el componente a ser estudiado. Contraste: permite detectar con mayor facilidad el producto de reacción. sensibilidad, especificidad y reproductibilidad Las reacciones deben tener 3 características: sensibilidad, especificidad y reproductibilidad.

5 MUESTRAS UTILIZADAS EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFÉRICA PUNCION DE MÉDULA ÓSEA PUNCION DE GANGLIOS LCR

6 TIPOS DE TINCIONES Se pueden clasificar en: Atendiendo al nivel de vitalidad de las células que se pretende colorear, se pueden dividir en vitales y no vitales. Atendiendo al momento en el que empezaron a ser utilizadas para el Dx hematológico, se dividen en tradicionales y especiales.

7 TINCIONES VITALES Y NO VITALES Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre células que están vivas. Las tinciones vitales son aquellas que se efectúan sobre células que están vivas, mediante la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo. Son colorantes vitales: el verde Jano y el azul de metileno. Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre células muertas. La coloración de células muertas requiere un proceso previo de fijación, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos.

8 TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad por las estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina (eosina). Colorantes básicos: tienen una especial afinidad por las estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos (azul de metileno). Colorantes neutros: son sales de un ácido y de una base coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro (eosinato de azul de metileno). Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen a aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante (Sudán III)

9 También hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polícromas. Una coloración es panóptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras. Y es pancrómica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas.

10 Las reacciones citoquímicas pueden también clasificarse según el mecanismo químico involucrado 1-Progresivas estables: Son reacciones que exigen un tiempo mínimo pero no un máximo. 2-Progresivas indefinidas: En estas la reacción continúa y puede hacer ilegible el preparado o conducir a valores erróneos. 3-Fugaces: Son las que pierden color rápidamente y no pueden conservarse mucho tiempo.

11 CLASIFICACION DE LAS TÉCNICAS CITOQUÍMICAS CITOQUÍMICA CLÁSICA INMUNOCITOQUÍMICA NO FLUORESCENTE CITOQUÍMICA FLUORESCENTECITOQUÍMICA ELCTRÓNICA CITOQUÍMICA AUTOMATIZADA

12 Citoquímica Clásica: Se fundamenta en reacciones coloreadas que pueden observarse e interpretarse con el microscopio óptico común. Citoquímica electrónica: Se caracteriza por ser una metodología de elevada sensibilidad Citoquímica Fluorescente: puede o no ser inmunocitoquímica, se fijan sobre distintas estructuras de las células y al ser excitadas por luz UV producen fluorescencias de distintos colores. Inmunocitoquímica no fluorescente: Se basa en la marcación de anticuerpos con sustancias que son capaces de dar reacciones citoquímicas intensamente coloreadas que permiten su revelación. Fisicocitoquímíca electroforética Permite reconocer determinados componentes de las organelas celulares obtenidas en solución mediante la lisis de la misma. Mediante electroforesis en un campo eléctrico y la identificación por reacciones citoquímicas, permite identificar complejos isoenzimáticos, mientras que los métodos citoquímicos simples revelan una enzima en bloque. Citoquímica automatizada: Es el fundamento de la CMF que utiliza la citoquímica fluorescente

13 CITOQUIMICA ELECTRONICA:

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15 CITOQUIMICA FLUORESCENTE: INMUNES NO INMUNES S P

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18 INMUNOCITOQUíMICA NO FLUORESCENTE

19 CITOQUIMICA AUTOMATIZADA:

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24 CONSIDERACIONES PRACTICAS Conservación de la muestra (FAL) Condiciones de la reacción Observación la microscopio (ausencia/presencia/,morfología/distribucion) Interpretación (score o ausencia/presencia) Estandarización Reactivos utilizados

25 Pueden ser reconocibles…. SUSTANCIAS RECONOCIBLES: 1-DNA Y RNA. 2-PROTEINAS. 3-HEMOGLOBINA. 4-HIDRATOS DE CARBONO. 5-LIPIDOS. 6-FOSFOLIPIDOS. 7-METALES ENZIMAS RECONOCIBLES 1-MIELOPEROXIDASAS (MPO) 2-FOSFATASA ALCALINA (FAL) 3-FOSFATASA ACIDA (FAC) 4-ESTERASAS (EST) 5-FOSFATASA ACIDA TARTRATO RESISTENTE (FAC-TR) 6-DEHIDROGENASAS (DH)

26 CITOQUIMICACLASICA CITOQUIMICA CLASICA Reconocimiento de principios no enzimáticos: Hidratos de carbonos: PAS Fe hemosiderínico: PERLS Lípidos: Red Oíl/Sudan Black Hemoglobina fetal: elución acida

27 Reconocimientos por principios enzimáticos: MPO FAL FAC ESTERASAS CATALASAS ENZIMAS HIDROLITICAS

28 TINCIONES CLASICAS: 1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO ENZIMATICOS

29 TINCIÓN DE PAS (Peryodic Schiff Acid) Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la acción del ácido peryódico, potente agente oxidante, liberándose grupos aldehído que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo púrpura intenso. -C-C- ALDEHIDOS PURPURA ACIDO PERYODICO SCHIFF

30 Progenie linfoide normales (-)Hasta llegar al linfocito donde un 30% es (+) en corona de gránulos Linfoblastos leucémicos (+)Positividad en mazacotes Serie roja normal (-)Serie roja anormal (+) [LMA6] Serie granulocitica (+) difusa PAS en neutrofilos con un patrón difuso

31 LMA6 (eritroide) MO PAS: todos los precursores eritroide contienen glucógeno, nunca los normales.

32 Reacción de PAS, médula ósea. Gránulos gruesos en el citoplasma de los linfoblastos.

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34 TINCION DE PERLS Los gránulos de hemosiderina detectables citoquímicamente mediante la reacción de Perls. Se basa en la liberación de los iones férricos de su unión con las proteínas por la acción del ácido clorhídrico; dichos iones férricos al reaccionar con el ferrocianuro potásico dan un precipitado azul verdoso de ferrocianuro férrico. Por esta reacción se detecta el Fe hemosiderínico, que es insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina que es hidrosoluble.

35 Sideroblastos en anillo Reflejando una anormalidad en la acumulacion de Fe en las mitocondrias (azul de prusia)

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37 HEMOSIDENURIA: hierro liberado en orina en una HPN

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39 En el estudio del Fe medular hay que valorar conjuntamente 3 parámetros: nº de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe macrofágico. Básicamente se presentas 3 patrones: 1) nº sideroblastos alto y Fe de depósito aumentado: es frecuente hallarlo en estados anémicos que cursan con sobrecarga férrica. 2) nº sideroblastos bajo y Fe de depósito disminuido o ausente: es el patrón característico de la anemia ferropénica pura; de aparición muy precoz en un balance férrico negativo. 3) nº sideroblastos bajo con acúmulo de Fe en los macrófagos medulares. Este patrón disociado es propio de entidades que condicionan un bloqueo del Fe a nivel de los macrófagos, por lo que el Fe no puede ser cedido a los eritroblastos, suele observarse en anemias secundarias.

40 Hemocromatosis (cortes histológicos de hígado)

41 HEMOGLOBINA FETAL Test de Kleihauer-Betke La hemoglobina fetal (HbF o 2 2 ) es ácido y álcali resistente. Por consiguiente, sometiendo un preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos. Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean con eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras.

42 Esta prueba se usa para determinar si hay GR del feto en una mujer embarazada con un grupo sanguíneo Rh(-).

43 SUDAN BLACK / RED OIL Ambas se utilizan para la detección de lípidos, en el caso del Sudan Black este tiñe los fosfolípidos y esteroles de membrana de los gránulos.

44 Tiñe tanto los gránulos azurófilos inespecíficos como los específicos de los neutrofilos

45 LMA2 (con eosinofilia t(8;21): intensa tinción de las células en maduración y de los gránulos de los eosinofilos anormales.

46 2) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS ENZIMATICOS

47 MIELOPEROXIDASA La demostración citoquímica de esta enzima se basa en la acción oxidante de la peroxidasa sobre un sustrato (bencidina) en presencia de peróxido de hidrógeno, apareciendo un precipitado azul en el lugar del citoplasma en donde se ha producido la reacción. BENCIDINA H2O2MPO

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49 Resultados…. ERITROCITOS Y SU PROGENIE : NEGATIVOS GRANULOCITOS Y SU PROGENIE : MIELOBLASTOS AGRANULARES 30% POSITIVOS. NEUTRÓFILO ES SIEMPRE POSITIVO 100% ?? EOSINÓFILO TAMBIÉN, PERO COLOR PARDO AMARILLO BASÓFILO EN 50% LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS MONOCITOS: POSITIVOS EN GRÁNULOS DISPERSOS.

50 ESTRES OXIDATIVO Scorificación de MPO en granulocitos: Se categorizaron los neutrófilos de acuerdo al contenido de gránulos presente en el citoplasma, en scores que van de 0 a 4, en orden creciente. Grado 0: Sin granulaciones teñidas. (fig. 1 y 2) Grado 1: Escasas granulaciones teñidas dispersas (fig.3 y 4)

51 Scorificación de MPO en granulocitos: Grado 2: Regulares granulaciones sin cubrir el núcleo (fig. 5) Grado 3: abundantes granulaciones teñidas en todo su citoplasma sin llegar a cubrir completamente el núcleo. (fig.6 )

52 Scorificación de MPO en granulocitos: Grado 4: granulaciones que cubren la célula completamente dándoles un aspecto de casquete. (fig.8 y 9)

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54 FOSFATASA ALCALINA La fosfatasa alcalina es una hidrolasa perteneciente al grupo de las fosfomonoesterasas. Ligeros cambios de pH determinan una rápida inactivación de la enzima. Es un marcador de granulaciones secundarias o especificas.

55 La demostración citoquímica se basa en la hidrólisis de ciertos substratos, de los cuales se liberan unos productos intermedios que combinados con una sal diazoica dan un precipitado coloreado.

56 La actividad granulocitica de la FA se manifiesta en forma de un precipitado de color pardo negruzco localizado en el citoplasma. Se encuentran actividad FA en algunas células maduras y semimaduras de la granulopoyesis neutrofilica (segmentados y bandas)

57 Índice de actividad de FAL Grado 0: sin reacción Grado I: coloración difusa o con pequeños puntos coloreados Grado II: mayor densidad cromática, por lo general en la zona del hilio nuclear. Grado III: mayor granulación oscura, tiñe todo el citoplasma. Grado IV: completamente oscuro

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59 FOSFATASA ACIDA Se basa en la hidrólisis del substrato naftol-AS-Bi-fosfato. La aplicación práctica del estudio de la FA se refiere sobre todo al estudio de los síndromes linfoproliferativos crónicos (LPC) y leucemia aguda linfoblástica (LAL), dónde existe una buena correlación entre el tipo de positividad y el fenotipo de membrana.

60 FAC LT(+) Y LB (-) El 90% de las LAL de origen T dan una reacción + intensa de localización centrosómica. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores elevados de FAC que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B.

61 LLA-T: INTENSA ACTIVIDAD CENTROSOMICA DE FOSFATASA ACIDA EN MAS DEL 70 % DE LOS BLASTOS. Tricoleucemia: Tinción fosfatasa ácida (+) tartrato resistente

62 4 sustratos: Naftol-AS-C-cloroacetato (CAE) Naftol-AS-D-acetato α-naftil-acetato Α-naftil-butirato hidrolizados precipitado insoluble sal diazoica ESTERASAS

63 ESTERASAS GR y su progenie Granulocitos y su progenie Linfocitos y su progenie Monocitos y su progenie Naftil butirato/ acetato Normales (-) (+) M6 (-) o con algunas granulaciones F Resit (-) o + débil(+++++) Fluoruro sensible Naftil cloro acetato Idem(+++++)(-)(+) Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar ésteres en sus componentes ácidos y alcoholes. Existen diferentes variedades según el substrato empleado.

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66 LMA5 (monocitica) MO TINCION DE ESTERASAS COMBINADAS: monoblastos teñidos de marrones (esterasas no especificas) y un neutrófilo teñido de azul (cloroacetoesterasa)

67 GranulocitosLinfocitosMonocitosPlaquetasEritrocitos Mb Seg Lbl Lin Mbl Mon Mg PqPEbl GR PAS Fe MPO FAL FAC ANAE NCAE Sudan Black EN RESUMEN…..

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