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Aislamiento de ADN Paula Bautista Bacterióloga. Métodos de aislamiento de ADN El aislamiento o extracción de ADN es el punto crucial en Biología Molecular.

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1 Aislamiento de ADN Paula Bautista Bacterióloga

2 Métodos de aislamiento de ADN El aislamiento o extracción de ADN es el punto crucial en Biología Molecular. Es el primer paso para realizar cualquier técnica de biología molecular.

3 Extracción y Purificación Extracción: sacar los componentes desde un compartimento celular. Involucra: Lisis de las células que contienen a los AN Inactivación de nucleasas Clarificación: separación de los AN de los restos celulares (debris). Purificación: Separación de AN: De proteínas solubles De otros AN no deseados De Lípidos, carbohidratos De sales y otros compuestos orgánicos

4 El problema Para muchas aplicaciones que involucran manipulación de AN es necesario disponer de éstos en estado puro. Por qué purificar? Nucleasas que se liberan al lisar las células degradan los ácidos nucléicos. Interferentes que inhiben los procedimientos posteriores. El desafío es separar los ácidos nucléicos deseados desde una mezcla compleja, manteniendo la integridad de los AN Contaminantes: Proteínas, lípidos y carbohidratos, sales del medio, iones, etc.

5 Muestra Lisis celular Separación y purificación Precipitación Calidad Cualitativo: electroforesis Cuantitativo: espectrofotometría UV Etapas básicas para Extracción y Purificación de AN Lugar de trabajo y material estéril, Además de guantes

6 1. Métodos de lisis celular El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadeza requerida para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN). Métodos Físicos (Baño María, Congelación- Descongelación Sonicación…) Métodos Químicos (Detergentes) Métodos Enzimáticos (Proteinasa K)

7 2. Separación y Purificación Permite la eliminación progresiva de proteínas y otros contaminantes celulares y la obtención de un material genético cada vez mas limpio. Desproteinización con fenol, que al denaturar proteínas causa su precipitación. Precipitación de proteínas con sales (salting out) Cromatografía De adsorción a sílica De filtración *** Lavados***

8 3. Precipitación Permite la obtención del ácido nucleíco listo para ser almacenado o diluido a la concentración deseada para su utilización.

9 Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los AN purificados Cantidad de material de partida Número de copias de las moléculas de AN Cantidad de tejido Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado) Contaminantes e interferentes en el material biológico

10 En el pasado, el proceso de extracción y purificación de ácidos nucleícos solía ser complicado, laborioso y limitado en términos de rendimiento. Actualmente existen muchos métodos especializados que pueden ser usados para extraer biomoléculas puras.

11 QIAGEN Es un técnica rápida y fácil para obtener ADN. El ADN puede ser obtenido a partir de sangre, plasma, suero, capa de blancos, tejido, células bucales, otros fluidos biológicos, cultivos celulares.

12 QIAGEN El buffer de lisis es ajustado para permitir fijar el ADN a la membrana. El ADN es absorbido por la membrana de sílica gel durante la centrifugación. Las condiciones de pH en el lisado aseguran que las proteínas y otros contaminantes que puedan inhibir la PCR y otras reacciones enzimáticas, no sean retenidas en la membrana.

13 Adsorción de DNA a sílica

14 Las muestras pueden estar en citrato, heparina o EDTA. No es necesaria una previa separación de leucocitos. El procedimiento de purificación se realiza usando las columnas y esto disminuye el grado de contaminación. Permite obtener un ADN libre de proteínas, nucleasas y otros contaminantes o inhibidores. Se obtiene buena concentración de ADN Las muestras pueden ser frescas o congeladas. VENTAJAS

15 Procedimiento

16 Verificación Calidad ADN Electroforesis en Gel de Agarosa

17

18 Gracias


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