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Comparative Proteomic Analysis of Extracellular Proteins Reveals Secretion of T-Kininogen from Vascular Smooth Muscle Cells in Response to Incubation with.

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Presentación del tema: "Comparative Proteomic Analysis of Extracellular Proteins Reveals Secretion of T-Kininogen from Vascular Smooth Muscle Cells in Response to Incubation with."— Transcripción de la presentación:

1 Comparative Proteomic Analysis of Extracellular Proteins Reveals Secretion of T-Kininogen from Vascular Smooth Muscle Cells in Response to Incubation with S-Enantiomer of Propanolol Jianjun Sui, Jianhua Zhang, Chi Bun Ching and Wei Ning Chen

2 Proteómica La proteómica comprende todas las proteínas presentes en un organismo, tejido o célula en particular en un momento determinado. En contraste con la genómica, la proteómica no es estática. Las diferencias en la expresión de proteínas no son accesibles a nivel genómico, pero si a nivel proteómico.

3 La información cuantitativa de las proteínas expresadas es necesaria y constituye un paso clave para entender por completo la función de las organelas, células, organismos; así como también los procesos de enfermedad.

4 La técnica de la proteómica puede resumirse en cuatro pasos fundamentales: -Aislamiento de la proteína y preparación -Separación de la proteína (HPLC, 1D gel electrophoresis, etc) -MS -Software bioinformático

5 Introducción Los receptores β adrenérgicos pertenecen a una familia de receptores acoplados a proteína G. Existen 3 tipos conocidos de β adrenoreceptores (β 1,β 2,β 3 ) β 1 Corazón y riñones β 2 Pulmones, tracto gastrointestinal, vasculatura y útero.

6 Receptor β2-Adrenérgico Structure of the β2- adrenergic receptor. The receptor protein is colored as a rainbow from blue at one end (N-terminus) to red at the other (C- terminus). In a cell, the long helices at the core of the molecule cross the cell membrane.

7 Propanolol R- Propanolol S-Propanolol

8 Es un β bloqueador no selectivo, que bloquea la acción de la epinefrina en ambos adrenoreceptores. Β-bloqueadores inhiben las acciones de los mediadores de epinefrina reduciendo el efecto en la tasa de excitación y fuerza de contracción miocárdica, dilatación de vasos sanguíneos y apertura de bronquios.

9 El propanolol es utilizado en arritmias ventriculares asociadas a cardiopatía isquémica, reduciendo la actividad arritmogénica en pacientes con infarto de miocardio previo. T-Kininógeno metabolitos activos (Kininas): BK B1 y B2 B2 protección contra isquemia

10 Objetivo Investigar la secreción de proteínas con diferentes niveles de expresión en medios de cultivo de células de tejido vascular liso (A7r5) incubadas por separado con los enantiómeros individuales del Propanolol usando el método de cuantificación iTRAQ acoplado con LC-MS/MS bidimensional.

11 Justificación β bloqueadores se administran como mezclas racémicas, aunque solo el enantiómero S tiene actividad sobre el receptor. β bloqueadores potenciales efectos adversos a dosis usuales.

12 Hipótesis El enantiómero S del propanolol provoca una mayor secreción protéica en las células de músculo liso vascular con respecto al enantiómero R.

13 Sección Experimental Se utilizó una estrategia que simultáneamente detecta y cuantifica diferencias en la secreción de proteínas en células de músculo liso vascular. Para esto se seleccionó un grupo de células (A7r5): Control Enantiómero S Enantiómero R

14 Condiciones del cultivo celular Células a 37ºC en atmósfera de 5% de CO 2 Luego de alcanzar el 80% de la expansión celular, se incubaron con el enantiómero R y S del propanolol (20M). Luego de 24 h, el medio de cultivo fue removido, filtrado y concentrado para su posterior análisis.

15 Tratamiento de muestras: Se etiquetaron las proteínas secretadas de cada medio de cultivo con los reactivos iTRAQ Control A7r5 = iTRAQ 114 Enantiómero S = iTRAQ 115 Enantiomero R = iTRAQ 117 Separación de proteínas mediante CL

16 Fragmentación e identificación de proteínas por MS Criterio: 2 o más péptidos deben ser identificados con un alto grado de confianza (>95%) Cuantificación con método Western Blot

17

18 Reactivos iTRAQ

19 Resultados

20

21 Figura 1: Espectro de masas T-Kininógeno

22 Análisis iTRAQ

23 Análisis Western-Blot

24 Discusión Células tratadas con el enantiómero S generaron mayor producción de T-Kininógeno. T-Kininógeno cuantificado péptidos de quinina vasoactivos bradiquinina: respuesta mediada por B1 y B2 B2: expresado en la mayoría de tejidos, protege contra la isquemia por disfunción cardiaca

25 En este artículo, por medio del análisis iTRAQ acoplado a 2D-LC/MS/MS y el análisis de Western Blot se logró demostrar por primera vez que las células A7r5 pueden secretar T-Kininógeno.

26 En Conclusión La aplicación de la proteómica cuantitativa provee un acercamiento efectivo para entender el mecanismo de acción del propanolol y aclara los roles de las proteínas (etiquetadas) durante la enfermedad. Es posible asociar el uso de propanolol en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares a través del T-Kininógeno.

27 Bibliografía Boehm A et all: Precise protein quantification based on peptide quantification using iTRAQ. BMC Bioinformatics 2007, 8:1-18. Ross L et all: Multiplex Protein Quantitation in Saccharomyces cerevusiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Molecular & Cellular Proteomics 2004, 3: Hansen K et all: Mass Spectrometric Analysis of Protein Mixture at Low Levels Using Cleavable 13 C-Isotope-coded Affinity Tag and Multidimensional Chromatography. Molecular & Cellular Proteomics 2003, 2:

28 Gracias


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