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Química Biológica I - Bioquímica I Ácidos Nucleicos: desnaturalización, curvas Cot, métodos de purificación, cuantificación y secuenciamiento.

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Presentación del tema: "Química Biológica I - Bioquímica I Ácidos Nucleicos: desnaturalización, curvas Cot, métodos de purificación, cuantificación y secuenciamiento."— Transcripción de la presentación:

1 Química Biológica I - Bioquímica I Ácidos Nucleicos: desnaturalización, curvas Cot, métodos de purificación, cuantificación y secuenciamiento

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4 Desnaturalización del DNA

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9 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata Purificación de ácidos nucleicos

10 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata

11 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata Purificación de ADN : Lisis de las células y solubilización del ADN Aplicación de métodos enzimáticos y/o químicos que remuevan proteínas, ARN y otras macromoléculas

12 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata Plásmidos

13 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata ADN total

14 PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

15 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata Purificación de RNA Pasos fundamentales en la purificación efectiva disrupción de células o tejido desnaturalización de complejos nucleoproteicos inactivación de la ribonucleasa (RNAasa) endógena purificación del RNA de DNA y proteínas contaminantes El principal problema en la purificación es que el RNA es muy susceptible a la degradación. Todos los métodos de purificación emplean agentes desnaturalizantes de la RNAasa Métodos más utilizados: 4 M tiocianato de guanidinio fenol y SDS (plantas) combinación de ambos

16 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata ARN

17 electrophoresis resolves DNA fragments of different size

18 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata

19 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata

20 Visualization of restriction fragments separated by gel electrophoresis

21 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata

22 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata

23 7.1 Restriction enzymes cut DNA molecules at specific sequences Figure 7-5a

24 7.1 Restriction enzymes cut DNA molecules at specific sequences Figure 7-5b

25 7.1 Selected restriction enzymes

26 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata

27 7.3 Pulsed-field gel electrophoresis separates large DNA molecules Figure 7-26

28 Identifying, analyzing, and sequencing DNA

29 Analyzing specific nucleic acids in complex mixtures

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32 7.5 Southern blotting detects specific DNA fragments Figure 7-32

33 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata

34 Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata Sondas Marcadas radioctivamente Marcadas no radioctivamente ( Digoxigenina, avidina) Se pueden obtener por: Sintesis química Extensión usando usando primers al azar PCR

35 Oligonucleotide probes are designed based on partial protein sequences

36 7.5 Northern blotting detects specific mRNAs Figure 7-33

37 The membrane-hybridization assay Figure 7-17 Double stranded DNA Melt DNA binds to filter Single-stranded DNA Incubate with labeled DNA Filter Hybridized complemetary DNAs Wash away labeled DNA that did not hybridize to DAN bound to filter Perform autoradiography

38 Identification of a specific clone from a phage library by membrane hybridization

39 Secuenciación de DNA

40 - Método Químico (Maxam & Gilbert) - Método Enzimático (Sanger) a) Manual b) Automático

41 7.3 DNA sequencing: the Maxam-Gilbert method Figure 7-27

42 Método Enzimático (Sanger)

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53 Secuenciación automática de DNA

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56 7.4 Bioinformatics Bioinformatics is the rapidly developing area of computer science devoted to collecting, organizing, and analyzing DNA and protein sequences Using searches based on homologous sequences, stored sequences suggest functions of newly identified genes and proteins Homologous proteins involved in genetic information processing are widely distributed

57 7.4 Comparative analysis of genomes reveals much about an organisms biology

58 7.4 The C. elegans genome encodes numerous proteins specific to multicellular organisms


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