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El laboratorio nos ayuda a conocer el agente etiológico.El laboratorio nos ayuda a conocer el agente etiológico. Las enfermedades por bacterias son frecuentes.

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2 El laboratorio nos ayuda a conocer el agente etiológico.El laboratorio nos ayuda a conocer el agente etiológico. Las enfermedades por bacterias son frecuentes por lo tanto sus estudios son los más usados.Las enfermedades por bacterias son frecuentes por lo tanto sus estudios son los más usados. Metodología de la toma de la muestra.Metodología de la toma de la muestra. Se usa desde la tinción hasta la genotipificación.Se usa desde la tinción hasta la genotipificación. Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

3 La más utilizada es la tinción de GramLa más utilizada es la tinción de Gram Ziehl- Neelsen y Kinyoun (carbol fucsina)Ziehl- Neelsen y Kinyoun (carbol fucsina) Carbol glicerol, permanganato de potasio se necesita microscopio de luz ultravioleta.Carbol glicerol, permanganato de potasio se necesita microscopio de luz ultravioleta. Tinta china hongos (Cryptococcus neoformans)Tinta china hongos (Cryptococcus neoformans) Hidróxido de potasio hongos en uñas y cabello.Hidróxido de potasio hongos en uñas y cabello. Blanco de Calcoflúor polisacáridos de la pared de hongos filamentosos y levaduriformes.Blanco de Calcoflúor polisacáridos de la pared de hongos filamentosos y levaduriformes. Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

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5 Histopatología. Esférula con endosporas. Tinción calcofluor. De: Mercy Hosp Toledo OH/Brian J. Harrington Dermatofitos, tinción de hidróxido de potasio Mycobacterias, Tinción de Ziehl- Neelsen criptosporidiosis, Tinción de Kinyoun Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

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7 Fundamento InmunoensayoInmunoensayo Ag - AcAg - Ac Métodos más usados ContrainmunoelectroforesisContrainmunoelectroforesis InmunofluorescenciaInmunofluorescencia Prueba de aglutinación con látexPrueba de aglutinación con látex CoaglutinaciónCoaglutinación Ensayo inmunoenzimático (ELISA)Ensayo inmunoenzimático (ELISA) Kumate-Gutiérrez. El laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Infectología clínica 17ª edición, 2008.

8 LCR, esputo, orina, suero, líquido sinovial Detecta nanogramos Requiere cantidades pequeñas del especímen clínico Capa delgada de gel de agarosa 1%. Se realizan dos pozos paralelos a una distancia de 3-4mm. En un pozo se coloca la muestra y en otro el anticuerpo vs el antígeno que se desea detectar. Se pasa una corriente a través del gel. Voltaje constante por min. Las cargas del Ag cátodo, el Ac ánodo. Si hay reacción Ag-Ac: Se visualiza una banda de precipitación entre ambos pozos. Técnica

9 Kumate-Gutiérrez. El laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Infectología clínica 17ª edición, Se utilizan partículas de látex cubiertas con Ac´s específicos. La muestra se coloca en laminillas y se le agrega la suspensión de látex. Se realizan movimientos rotatorios por 3-10 minutos. Si hay reacción Ag- Ac, se observará aglutinación macroscópica: prueba positiva. COAGLUTINACIÓN. Se utiliza una sepa de S. aureus productor de proteína A (cepa Cowan) que son cubiertos por Ac´s específicos. Técnica

10 Kumate-Gutiérrez. El laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Infectología clínica 17ª edición, Identificación de complejos Ag-Ac mediante el empleo de enzimas. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Sobre una fase sólida (nitrocelulosa, poliestireno, perlas de plástico o microtubos) son fijados los anticuerpos. Se agrega la muestra pretratada y se incuba. Se agrega un segundo anticuerpo con una enzima (peroxidasa) dirgido vs el antígeno, se incuba y se lava otra vez. Se agrega el sustrato de la enzima y se produce un cambio de color macroscópico o puede medirse con espectrofotómetro. Principios básicos

11 Kumate-Gutiérrez. El laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Infectología clínica 17ª edición, 2008.

12 La inmunofluorescencia es una técnica de inmunomarcación que hace uso de anticuerpos unidos químicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una determinada molécula, en un microorganismo o tejido. Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas,

13 El anticuerpo marcado se hace reaccionar contra un preparado biológico Exposición de la muestra a una fuente de luz de onda corta (ultravioleta o azul) seleccionada. La luz emitida puede ser cuantificada con facilidad por microscopia de fluorescencia en preparados histológicos Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Unión Molécula fluorescente a un anticuerpo. Isotiocianato de fluoresceína. REACCIÓN DE POSITIVA: Acoplamiento de Ag-Ac produciendo una fluorescencia.

14 UTILIDADES: CLÍNICA: ETS, influenza, dengue, etc. INVESTIGACIÓNCLÍNICA: INVESTIGACIÓN VENTAJAS VENTAJAS - Se pueden obtener resultados rápidos. -No es necesario realizar cultivos. -Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto. -Determina la identidad de un organismo muerto. VENTAJAS VENTAJAS - Se pueden obtener resultados rápidos. -No es necesario realizar cultivos. -Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto. -Determina la identidad de un organismo muerto. DESVENTAJAS DESVENTAJAS - Costos en reactivo y equipo -Debe ser realizado por personal muy especializado. DESVENTAJAS DESVENTAJAS - Costos en reactivo y equipo -Debe ser realizado por personal muy especializado. Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, puede ser utilizada en cortes de tejidos, líneas celulares cultivadas, células individuales y secreciones con la finalidad de analizar la presencia y distribución de proteínas, glúcidos y moléculas sobre el tejido.

15 INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA: Esta se vale de un Ac primario marcado con un fluorocromo( fluresceína), que reacciona con el antígeno dentro de la muestra. Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas El anticuerpo reconoce la molécula diana y se une a ella directamente. Ventajas: Es rápida. Poca sensibilidad. El anticuerpo reconoce la molécula diana y se une a ella directamente. Ventajas: Es rápida. Poca sensibilidad.

16 Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

17 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA: Hace uso de dos anticuerpos; el anticuerpo primario es el que reconoce y se une a al molécula diana, mientras que el secundario que es el que se encuentra marcado con el fluoróforo, reconoce al primario y se une a él.

18 Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

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20 Es un examen de laboratorio solicitado con mucha frecuencia al que el clínico se enfrenta desde la valoración de un sujeto hasta el seguimiento de enfermedades hematológicas y no hematológicas Hemograma o citometría hemática (CH). Serie roja Serie blanca Serie trombocítica Estudio de tres líneas celulares Fisiológicos. Edad, embarazo, actividad física, clima y localización geográfica. Patológicos. Procesos inflamatorios, metabólicos, neoplásicos, infecciosos. Valores alterados RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, 2004.

21 Dependerá de factores como: edad, peso, hábito tabáquico, etc. Leucocitosis > y Leucopenia < ɥ L Etiología Errores bajo citometría de flujo: fragilidad leucocitaria (fármacos inmunosupresores o citotóxicos), formación de agregados. Leucocitos totales4000 – / ɥ L RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, Célula(%)Límites absolutos Leucocitos totales Neutrófilos Eosinófilos Basófilos Monocitos Linfocito – ɥ L – <100 – 200 < 10 – – – 4 200

22 Leucocitos Leucocitosis > / ɥ L RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, Causas de leucocitosis Infecciones agudas Intoxicaciones Hemorragia aguda Hemólisis Padecimientos mielo o linfoproliferativos Necrosis tisular Condiciones fisiológicos Localizadas: Neumonías, meningitis, abscesos, amigdalitis, apendicitis. Generalizadas: Fiebre reumática aguda, septicemia, cólera, endocarditis infecciosa. Metabólicas: uremia, etc. Otras: veneno de arácnidos,etc Leucemias crónicas, policitemia vera IAM, quemaduras Ejercicio, trabajo de parto, menstruación. Causas de leucopenia Infecciones agudas Fármacos Radiación Otros Bacterianas: Septicemia, TB miliar, tifoidea, brucelosis, rickettsias (tifo). Paludismo Virales: Mononucleosis infecciosa, hepatitis, influenza, parotiditis. Sulfonamidas, analgésicos, mielosupresores. LES, AR, Insuficiencia renal, shock anafiláctico. Leucocitos Leucopenia > 4 000/ ɥ L

23 Neutropenia: < ɥ L Neutrofilia > ɥ L. Relacionada a incremento de bandas Bandemia: > 800 ɥ L Causas iguales a las señaladas para leucocitosis. Leucoblastosis. Leucocitosis + Bandas Leucoeritroblastosis: Leucistosis + Bandas + Blastos SR. Neutrófilos – / ɥ L RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, Causas de leucoblastosis /leucoeritroblastosis Infecciosas Quemaduras Eclampsia Envenenamientos Hemólisis aguda Hemorragia aguda Ca metastásico a MO Endocarditis infecciosa Neumonía Leptospirosis Causas de neutropenia InfecciosasBacterianas: Septicemia, TB miliar, tifoidea, brucelosis, rickettsias (tifo). Paludismo Virales: Mononucleosis infecciosa, hepatitis, influenza, parotiditis. Sulfonamidas, analgésicos, mielosupresores. Causas de neutrofilia InfecciosasLocalizadas: Neumonías, meningitis, abscesos, amigdalitis, apendicitis. Generalizadas: Fiebre reumática aguda, septicemia, cólera, endocarditis infecciosa.

24 Lo más común es encontrar Eosinofilia: >0.5 x 10^9/L Eosinopenia, término poco usado porque se acepta que no haya eosinófilos en una cuenta normal de leucocitos. Eosinófilos<100 – 200 / ɥ L RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, Causas de eosinofilia Parasitosis Otras enfermedades infecciosas Enfermedades alérgicas Gastrointestinales Hematológicas Triquinosis, ascaridiasis, toxocariasis, oxiuros (raro) Escarlatina Asma, fiebre del heno, urticaria Gastroenteritis eosinofílica, CUCI Síndrome hipereosinofílico, leucemia mieloide crónica, policitemia vera, Hodgkin

25 Basofilia Basófilos < 10 – 20 / ɥ L RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, Causas de basofilia Infecciosas Otras Rara (varicela, sarampión) Leucemia mieloide crónica, policitemia vera, metaplasia mieloide, Hodgkin, anemia hemolítica, sinusitis crónica, esplenectomía, etc.

26 Monocitosis > / ɥ L Monocitos / ɥ L RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, Causas de monocitosis Infecciosas Otras TB, paludismo, endocarditis infecciosa, brucelosis, tripanosomiasis, rickettsiasis Virales: VVZ, CMV Leucemias, Hodgkin, linfomas, recuperación de daño medular por radiaciones o medicamentos,kala azar, CUCI.

27 Linfopenia < / ɥ L Linfocitosis > / ɥ L Linfocitos – / ɥ L RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, Causas de linfocitosis Infecciosas Otras Virales: Varicela, tos ferina, mononucleosis infecciosa, hepatitis, parotiditis, rubeóla, CMV. Otros agentes: TB, brucelosis, sífilies, toxoplasmosis. Leucemia linfática, tirotoxicosis, linfomas.

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29 { Es el proceso de crecimiento de m.o. mediante la toma de bacterias de un sitio de infección por método de recolección de muestra y crecimiento en un medio ambiente artificial. Facilitar el aislamiento y crecimiento. Determinar cuales de las bacterias que se desarrollan es más probable que sean la causa de infección Desarrollo suficiente para su identificación y caracterización

30 Debe ser de material del sitio real de infección, con el mínimo de contaminación Establecer los momentos óptimos para la toma de muestras Cantidad de muestra suficiente Utilización adecuada de dispositivos de recuperación envases para muestras y medio de cultivo

31 < INICIO DE ANTIBIOTICOS 2-3 MUESTRAS (85-90%) BACTEREMIAS Vol. Requerido: Adultos 5-10 ml. Niños 1-2 ml. RN mantener la proporción 1:10 MUESTRA Enriquecidos y suplementados junto con un anticoagulante (polianetol de sodio) CULTIVO

32 CULTIVO DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Paciente en decúbito lateral o sentado, con flexión de la cabeza y los muslos A nivel de L4-L5 3-5 ml., fraccionado en varis tubos Citoquímico y citológico Aglutinación con latex Cultivo

33 UROCULTIVO Muestra de chorro medio, sonda transuretral, punción suprapúbica y con bolsa colectora Realizar aseo amplio con agua y jabón la zona periuretral La muestra debe ser procesada en 30 minutos hr.

34 CULTIVO DE EXUDADO FARINGEO CON SIGNIFICADO CLÍNICO S. PyogenesHaemophilus influenzae Corynebacterium diphtheriae S. Pneumoniae N. MeningitidisM. Catarrhalis N. gonorrhoeaeS. agalactiae Muestra tomada con hisopos estériles e inocularse en medios de transporte semisólidos (Stuart) Muestra tomada con hisopos estériles e inocularse en medios de transporte semisólidos (Stuart)

35 MEDIO STUART DE TRANSPORTE Cloruro de sodio3 g. Cloruro de potasio0.2 g. Fosfato disódico1.25 g. Trioglicato de sodio1 g. Cloruro de calcio10 g. Agar4 g. Agua destilada1 L Mantener la muestra tan próxima a su estado original como sea posible, con deterior mínimo, y minimizando el riesgo que afrontan quienes transportan la muestra, mediante el uso de recipientes herméticamente cerrados.

36 Esterilización de los medios Condiciones óptimas de incubación Evaluación de la morfología de la colonia Coloración de Gram y subcultivos

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38 De acuerdo con su función y uso. Hay 3 categorías generales de medios: MEDIOS NO SELECTIVOS: Crecimiento con gran variedad de m.o., en corto tiempo Agar sangre, Agar chocolate, Agar Müller-Hinton MEDIOS SELECTIVOS: Contienen substancias que buscan inh. la mayoría de los m.o. Agar sal-manitol, Agar MacConkey, Agar sabouraud MEDIOS DIFERENCIALES: Agar sangre (efecto hemolítico),Agar salmanitol, Agar MacConkey (fermentación lactosa), Agar TSI (Producción ác. Sulfídrico), MIO

39 MEDIOCOMPONENTESOBJETIVO PRINCIPAL Agar chocolate Base de peptona, enriquecida con una solución de Hb al 2% Cultivos de especies de Haemophilus y especies patógenas de Neisseria Agar MacConkey Gram (+) son inhibidos por el cristal violeta y sales biliares. Rojo neutro como indicador Bacilos entéricos gram (-) fermentadores y no fermentadores Agar sangre Infusión de carne y corazón con 5% de sangre de carnero Requerimientos especiales, reacciones hemolíticas Agar XLD El desoxicolato de sodio inh. Los m.o. gram (+); rojo fenol indicador Especies de Salmonella y Shigella, de otros bacilos entérico gram (-) (amarillo) Agar salmanitol Base de peptona, manitol y rojo fenol indicador, sal al 7.5% Selectivo para estafilococos Agar SS Base de peptona con lactosa, rojo neutro indicador Salmonella y Shigella

40 S. aureus S. epidermidis S. haemolyticus S. saprophyticus Especies de Micrococcus MEDIOS DE CULTIVOS DE ELECCIÓN.- Agar sangre o Agar chocolate Cultico selectivo: Agar manitol (halo amarillo) Incubación a 35° C x hr. COLONIAS S AUREUS: Medianas-grandes, elevadas, traslucidas; con pigmento amarillo, la mayoría betahemolíticas

41 S. Betahemolítico (pyogenes) S. Pneumoniae S. Viridans Enterococos ( faecalis y fecium MEDIOS DE CULTIVO.- Agar sangre de oveja al 5% y agar chocolate Betahemolisis, es mejor en condiciones anaeróbicas Período de incubación 48 hr ASPECTO COLONIAS.- Translucida a opacas; planas, brillantes, ancho estrecho de betahemólisis

42 Moraxella catarrhalis N. gonorrhoeae N meningitides MEDIO DE ELECCIÓN Agar sangre de carnero al 5% Agar chocolate Medios selectivos: Thayer Martin (agar chocolate + suplemento y antimicrobianos colistina, nistatina y vancomicina) Incubación a 35-37° C x 72 horas En una atmosfera húmeda enriquecida en CO2 ASPECTO DE LAS COLONIAS MC: Grande, no pigmentada o gris, opaca, lisa; consistencia friable NG: Pequeñas, blanco-grisaceas, convexas, translúcidas, brillantes.

43 BACILOS GRAMPOSITIVOS Corynebaterium: Amycolatum Auris diphteriae Listeria monocytogenes MEDIOS DE CULTIVO Agar sangre de carnero al 5% Agar chocolate NO agar MacConkey Incubación a 35°C en 48 hr.-3 días Color negro gris

44 Burkholderia pseudomallei Burkholderia cepacia Pseudomona aeruginosa P. alcaligenes P. fluorescens P. luteola MEDIOS DE CULTIVO Agar sangre de oveja al 5% Agar chocolate Agar MacConkey, caldos de los sistemas de hemocultivo Incubación a 35° C en CO2 o aire atmosférico x horas >siembra COLONIAS.- Esparcidas, planas y con bordes dentados, brillo metálico, colonias betahemolíticas, pigmentación verde azulada

45 Brucella abortus Brcella meltensis B. canis B. suis Bacilos cortos o cocobacilos gramnegativos, inmóviles y aerobios; requieren CO2 MEDIOS DE CULTIVO Sistemas comerciales para hemocultivo (BACTEC, lisis- centrifugación) Incubación prolongada x 30 días Atmosfera humidificada con CO2 al 5-10% ASPECTO COLONIAS.- Pequeñas, convexas, lisas, traslúcidas no hemolíticas, amarillo pálido

46 M. tuberculosis M. Bovis BCG M. Bovis M. africanus M. No tuberculosas Complejo M. avium M. Simiae M. Celatum M. fortuitum Bacilos inmóviles muy delgados Ácido-alcohol resistentes MEDIO DE CULTIVO.- Se requiere la combinación de medios de cultivo sólidos líquidos SOLIDOS: Lowenstein-Jensen. 35° C en la obscuridad con una atmosfera con 5-10% de CO2 y humedad elevada x 3-6 semanas Agar chocolate LÍQUIDOS: BACTEC. Atmosfera 5-10% de CO2 x 1º días

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49 Costoso Mucho tiempo No siempre se pueden aislar los microorganismos Genotipo Dx microoganismos de difícil cultivo Mycobacterias y Legionella ID secuencias de DNA

50 Análisis de DAN o RNA Detección de segmentos dentro de otros no específicos Enzimas de restricción DNA varios millones fragmentos RNA 1/1000 Electroforesis en gel Hibridación con sonda para ID mol. interés

51 ID gen especifico del microorganismo Segmentos cortos Iniciadores para amplificación PCR Hibridación de segmentos complementarios Segmentos largos Sondas

52 ADN o ARN Muestras clínicas o Cultivos In situ en céls. En laminillas en el microscopio Común fijados en formalina y embebidos en parafina

53 Southern blot Ed southern años 70 Analisis fragmentos de DNA generados por enzimas de restricción EnzimaOrganismoSitio de rotura 5´ 3 Bam HIBacillus amyloliquefaciens H G * GATCC Eco RIE. Coli RY 13G * AATTC HaeIIIH aegyptusGG * CC Hind IIIH. Influenzae RdA * AGCTT Hpa IH. ParainfluenzaeGTT * AAC Pst IProvidencia stuartiiCTGCA * G Sma ISerratia marcescensCCC * GGG Sal IStrptomices albus GG * TCGAC

54 Enzima de restricción Separación por electroforesis Gel de agarosaDesnaturalización Filtro nitrocelulosa (transparencia y capilaridad) Incubación del filtro Hibridación Exposición a rayos X o a película sensible a la luz

55 AplicaciónOrganismo Detección directa de muestras clínicasChlamydia trachomatis Streptococcus del grupo A Papilomavirus Neisseria gonorrhoeae Confirmación de cultivosCoccidioides immitis Haemophilus influenzae Histoplasma capsulatum Mycobacterium tuberculosis complex Listeria monocitogenes

56 Determinar tamaño y abundancia de mRNA derivado de un determinado gen No enzimas de restricción Longitud por exones

57 PCR Alternativa a la clonación Miles de millones de copias en pocas horas Iniciadores específicos de genes cuya secuencia es conocida Alta sensibilidad Reacción cruzada 1 trepano-inmediato CMV 23S E. Coli Inhibidores de la polimerasa

58 PCR Amplificación enzimática de un fragmento de DNA diana Desnaturalización con calor Cebadores cadenas complementarias DNA polimerasa 2 nuevas cadenas Repetidos ciclos

59 Desnaturalización de las cadenas de ADN Hibridación de los iniciadores Extensión de la secuencia amplificada Termociclado r PCR-RT PCR - multiplexLCR (Ligasa Chain Reaction) Hibridación con sondas especificas Amplificación de las sondas Ligamiento Producir cadenas duplicadas

60 Cantidad de DNA concreta existente en una muestra Se duplica x cada ciclo Seguimiento fases iniciales Umbral arbitrario PCR tiempo real

61 Enzimática Radioactiva Quimioluminiscente Fluorescente Cualitativa Cuantitativa Multiplicación de la señal Reacción Secuencia blanco Sondas Señal

62 OrganismoNombre de la prueba MétodoLimite de detección Aplicación HIV 1AmplicorPCR<100 copias/mlPrueba confirmatoria HIV 1MonitorPCR cuantitativo400 – 750,000 copias/ml Cuantificación durante terapia HCVMonitorPCR cuantitativo200 – 10,000,000 copias/ml Cuantificación durante terapia M. TuberculosisAmplicorPCR>20 organismo/RXN Pacientes no tratados y baciloscopia + C. TrachomatisAmplicorPCR10-20 cuerpos elementales/RXN Confirmación y monitoreo EnterovirusAmplicorPCRNo reportadoConfirmación y monitoreo VHCQuantiplexDNA ramificado200, x10 6 copias/ml Cuantificación durante terapia VHBQuantiplexDNA ramificado.7x x10 6 copias/ml Confirmación y monitoreo N. gonorrhoeaeLCXLCRNo reportadoConfirmación y monitoreo


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