LABORATORIO EN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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1 LABORATORIO EN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
AGUIRRE VIDAL IXCHEL BOBADILLA MALDONADO JONATAN PIÑA RAMÍREZ LUIS EDUARDO ROSAS CARRERA ANA ELENA VEGA REZA KAREN ARIADNA

2 INTRODUCCIÓN El laboratorio nos ayuda a conocer el agente etiológico.
Las enfermedades por bacterias son frecuentes por lo tanto sus estudios son los más usados. Metodología de la toma de la muestra. Se usa desde la tinción hasta la genotipificación. Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

3 TINCIONES La más utilizada es la tinción de Gram
Ziehl- Neelsen y Kinyoun (carbol fucsina) Carbol glicerol, permanganato de potasio→ se necesita microscopio de luz ultravioleta. Tinta china→ hongos (Cryptococcus neoformans) Hidróxido de potasio→ hongos en uñas y cabello. Blanco de Calcoflúor→ polisacáridos de la pared de hongos filamentosos y levaduriformes. Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

4 Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

5 Histopatología. Esférula con endosporas. Tinción calcofluor
Histopatología. Esférula con endosporas. Tinción calcofluor. De: Mercy Hosp Toledo OH/Brian J. Harrington Mycobacterias, Tinción de Ziehl- Neelsen Histopatología. Esférula con endosporas. Tinción calcofluor. De: Mercy Hosp Toledo OH/Brian J. Harrington criptosporidiosis, Tinción de Kinyoun Dermatofitos, tinción de hidróxido de potasio Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

6 PRUEBAS RÁPIDAS PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS Y ANTÍGENOS

7 GENERALIDADES Fundamento Inmunoensayo Ag - Ac Métodos más usados
Contrainmunoelectroforesis Inmunofluorescencia Prueba de aglutinación con látex Coaglutinación Ensayo inmunoenzimático (ELISA) Kumate-Gutiérrez. El laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Infectología clínica 17ª edición, 2008.

8 CONTRAINMUNOELECTROFORESIS
LCR, esputo, orina, suero, líquido sinovial Detecta nanogramos Requiere cantidades pequeñas del especímen clínico Capa delgada de gel de agarosa 1%. Se realizan dos “pozos” paralelos a una distancia de 3-4mm. En un pozo se coloca la muestra y en otro el anticuerpo vs el antígeno que se desea detectar. Se pasa una corriente a través del gel. Voltaje constante por min. Las cargas del Ag  cátodo, el Ac  ánodo. Si hay reacción Ag-Ac: Se visualiza una banda de precipitación entre ambos pozos. Técnica Kumate-Gutiérrez. El laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Infectología clínica 17ª edición, 2008.

9 AGLUTINACIÓN Y COAGLUTINACIÓN CON LÁTEX
Se utilizan partículas de látex cubiertas con Ac´s específicos. La muestra se coloca en laminillas y se le agrega la suspensión de látex. Se realizan movimientos rotatorios por 3-10 minutos. Si hay reacción Ag- Ac, se observará aglutinación macroscópica: prueba positiva. COAGLUTINACIÓN. Se utiliza una sepa de S. aureus productor de proteína A (cepa Cowan) que son cubiertos por Ac´s específicos. Técnica Kumate-Gutiérrez. El laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Infectología clínica 17ª edición, 2008.

10 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
Identificación de complejos Ag-Ac mediante el empleo de enzimas. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Sobre una fase sólida (nitrocelulosa, poliestireno, perlas de plástico o microtubos) son fijados los anticuerpos. Se agrega la muestra pretratada y se incuba. Se agrega un segundo anticuerpo con una enzima (peroxidasa) dirgido vs el antígeno, se incuba y se lava otra vez. Se agrega el sustrato de la enzima y se produce un cambio de color macroscópico o puede medirse con espectrofotómetro. Principios básicos El ensayo de ELISA puede ser directo o no competitivo, constando de los siguientes pasos: a) Se tapiza la placa con el anticuerpo específico frente al antígeno a determinar. b) Se añade la muestra con el antígeno. c) Se adiciona el anticuerpo secundario marcado con la enzima que en presencia de su sustrato da un producto coloreado soluble, este producto es cuantificado mediante el lector de ELISA (Figura 21), e indirecto o competitivo, se diferencia del caso anterior en que se añaden los anticuerpos, previamente incubados con la muestra, los anticuerpos que no se han unido a los antígenos de la muestra lo harán a los antígenos de los pocillos. Como enzimas se suelen utilizar la peroxidasa, la galactosidasa o la glucosa oxidasa Kumate-Gutiérrez. El laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Infectología clínica 17ª edición, 2008.

11 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
Kumate-Gutiérrez. El laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Infectología clínica 17ª edición, 2008.

12 INMUNOFLUORESCENCIA La inmunofluorescencia es una técnica de inmunomarcación que hace uso de anticuerpos unidos químicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una determinada molécula, en un microorganismo o tejido. Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas,

13 TÉCNICA REACCIÓN DE POSITIVA:
Unión Molécula fluorescente a un anticuerpo. Isotiocianato de fluoresceína. El anticuerpo marcado se hace reaccionar contra un preparado biológico REACCIÓN DE POSITIVA: Exposición de la muestra a una fuente de luz de onda corta (ultravioleta o azul) seleccionada. Acoplamiento de Ag-Ac produciendo una fluorescencia. La luz emitida puede ser cuantificada con facilidad por microscopia de fluorescencia en preparados histológicos Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas.

14 ETS, influenza, dengue, etc.
INMUNOFLUORESCENCIA puede ser utilizada en cortes de tejidos, líneas celulares cultivadas, células individuales y secreciones con la finalidad de analizar la presencia y distribución de proteínas, glúcidos y moléculas sobre el tejido. CLÍNICA: ETS, influenza, dengue, etc. INVESTIGACIÓN UTILIDADES: VENTAJAS 
 - Se pueden obtener resultados rápidos. -No es necesario realizar cultivos. -Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto. -Determina la identidad de un organismo muerto. DESVENTAJAS 
 -Costos en reactivo y equipo -Debe ser realizado por personal muy especializado. Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas,

15 INMUNOFLUORESCENCIA INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA: Esta se vale de un Ac primario marcado con un fluorocromo( fluresceína), que reacciona con el antígeno dentro de la muestra. El anticuerpo reconoce la molécula diana y se une a ella directamente. Ventajas: Es rápida. Poca sensibilidad. Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

16 Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

17 INMUNOFLUORESCENCIA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA: Hace uso de dos anticuerpos; el anticuerpo primario es el que reconoce y se une a al molécula diana, mientras que el secundario que es el que se encuentra marcado con el fluoróforo, reconoce al primario y se une a él. Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

18 Kumate- Gtz, Infectología clínica, 17ma edición, Méndez Editores, México, DF (2008) Cap. 8 Laboratorio en el diagnóstico de enfermedades infecciosas

19 BIOMETRÍA HEMÁTICA

20 BIOMETRÍA HEMÁTICA Hemograma o citometría hemática (CH).
Es un examen de laboratorio solicitado con mucha frecuencia al que el clínico se enfrenta desde la valoración de un sujeto hasta el seguimiento de enfermedades hematológicas y no hematológicas Hemograma o citometría hemática (CH). Serie roja Serie blanca Serie trombocítica Estudio de tres líneas celulares Fisiológicos. Edad, embarazo, actividad física, clima y localización geográfica. Patológicos. Procesos inflamatorios, metabólicos, neoplásicos, infecciosos. Valores alterados RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, 2004.

21 CITOMETRÍA HEMÁTICA: SERIE BLANCA
Dependerá de factores como: edad, peso, hábito tabáquico, etc. Leucocitosis > y Leucopenia < ɥL Etiología Errores bajo citometría de flujo: fragilidad leucocitaria (fármacos inmunosupresores o citotóxicos), formación de agregados. Leucocitos totales – /ɥL Célula (%) Límites absolutos Leucocitos totales Neutrófilos Eosinófilos Basófilos Monocitos Linfocito 40 -85 0 -7 0 -3 1 -13 4 000– ɥL 1 500 – 7 000 <100 – 200 < 10 – 20 100 – 800 1 000 – 4 200 RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, 2004.

22 CITOMETRÍA HEMÁTICA: SERIE BLANCA
Leucocitos Leucocitosis > /ɥL Leucocitos Leucopenia > 4 000/ɥL Causas de leucopenia Infecciones agudas Fármacos Radiación Otros Bacterianas: Septicemia, TB miliar, tifoidea, brucelosis, rickettsias (tifo). Paludismo Virales: Mononucleosis infecciosa, hepatitis, influenza, parotiditis. Sulfonamidas, analgésicos, mielosupresores. LES, AR, Insuficiencia renal, shock anafiláctico. Causas de leucocitosis Infecciones agudas Intoxicaciones Hemorragia aguda Hemólisis Padecimientos mielo o linfoproliferativos Necrosis tisular Condiciones fisiológicos Localizadas: Neumonías, meningitis, abscesos, amigdalitis, apendicitis. Generalizadas: Fiebre reumática aguda, septicemia, cólera, endocarditis infecciosa. Metabólicas: uremia, etc. Otras: veneno de arácnidos,etc Leucemias crónicas, policitemia vera IAM, quemaduras Ejercicio, trabajo de parto, menstruación. RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, 2004.

23 CITOMETRÍA HEMÁTICA: SERIE BLANCA
Neutropenia: < ɥL Neutrofilia > ɥL. Relacionada a incremento de “bandas” Bandemia: > 800 ɥL Causas iguales a las señaladas para leucocitosis. Leucoblastosis. Leucocitosis + Bandas Leucoeritroblastosis: Leucistosis + Bandas + Blastos SR. Neutrófilos – /ɥL Causas de neutrofilia Infecciosas Localizadas: Neumonías, meningitis, abscesos, amigdalitis, apendicitis. Generalizadas: Fiebre reumática aguda, septicemia, cólera, endocarditis infecciosa. Causas de neutropenia Infecciosas Bacterianas: Septicemia, TB miliar, tifoidea, brucelosis, rickettsias (tifo). Paludismo Virales: Mononucleosis infecciosa, hepatitis, influenza, parotiditis. Sulfonamidas, analgésicos, mielosupresores. Causas de leucoblastosis /leucoeritroblastosis Infecciosas Quemaduras Eclampsia Envenenamientos Hemólisis aguda Hemorragia aguda Ca metastásico a MO Endocarditis infecciosa Neumonía Leptospirosis RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, 2004.

24 CITOMETRÍA HEMÁTICA: SERIE BLANCA
Lo más común es encontrar Eosinofilia: >0.5 x 10^9/L Eosinopenia, término poco usado porque se acepta que no haya eosinófilos en una cuenta normal de leucocitos. Eosinófilos <100 – 200 /ɥL Causas de eosinofilia Parasitosis Otras enfermedades infecciosas Enfermedades alérgicas Gastrointestinales Hematológicas Triquinosis, ascaridiasis, toxocariasis, oxiuros (raro) Escarlatina Asma, fiebre del heno, urticaria Gastroenteritis eosinofílica, CUCI Síndrome hipereosinofílico, leucemia mieloide crónica, policitemia vera, Hodgkin RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, 2004.

25 CITOMETRÍA HEMÁTICA: SERIE BLANCA
Basofilia Basófilos < 10 – 20 /ɥL Causas de basofilia Infecciosas Otras Rara (varicela, sarampión) Leucemia mieloide crónica, policitemia vera, metaplasia mieloide, Hodgkin, anemia hemolítica, sinusitis crónica, esplenectomía, etc. RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, 2004.

26 CITOMETRÍA HEMÁTICA: SERIE BLANCA
Monocitosis > /ɥL Monocitos /ɥL Causas de monocitosis Infecciosas Otras TB, paludismo, endocarditis infecciosa, brucelosis, tripanosomiasis, rickettsiasis Virales: VVZ, CMV Leucemias, Hodgkin, linfomas, recuperación de daño medular por radiaciones o medicamentos,kala azar, CUCI. RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, 2004.

27 CITOMETRÍA HEMÁTICA: SERIE BLANCA
Linfopenia < /ɥL Linfocitosis > /ɥL Linfocitos – /ɥL Causas de linfocitosis Infecciosas Otras Virales: Varicela, tos ferina, mononucleosis infecciosa, hepatitis, parotiditis, rubeóla, CMV. Otros agentes: TB, brucelosis, sífilies, toxoplasmosis. Leucemia linfática, tirotoxicosis, linfomas. RUÍZ ARGÜELLES G – RUIZ REYES G. INTERPRETACIÓN DE LA CITOMETRÍA HEMÁTICA. ÍNDICES Y PARÁMETROS. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGÍA 3ª e. EDITORIAL PANAMERICANA, 2004.

28 CULTIVOS

29 Es el proceso de crecimiento de m. o
Es el proceso de crecimiento de m.o. mediante la toma de bacterias de un sitio de infección por método de recolección de muestra y crecimiento en un medio ambiente artificial. Facilitar el aislamiento y crecimiento. Determinar cuales de las bacterias que se desarrollan es más probable que sean la causa de infección Desarrollo suficiente para su identificación y caracterización

30 TOMA DE MUESTRA Debe ser de material del sitio real de infección , con el mínimo de contaminación Establecer los momentos óptimos para la toma de muestras Cantidad de muestra suficiente Utilización adecuada de dispositivos de recuperación envases para muestras y medio de cultivo

31 HEMOCULTIVOS < INICIO DE ANTIBIOTICOS 2-3 MUESTRAS (85-90%)
BACTEREMIAS Vol. Requerido: Adultos 5-10 ml. Niños 1-2 ml. RN mantener la proporción 1:10 MUESTRA Enriquecidos y suplementados junto con un anticoagulante (polianetol de sodio) CULTIVO Cada hemocultivo deberá tomarse de un acceso venoso diferente, con un intervalo de minutos

32 CULTIVO DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
Paciente en decúbito lateral o sentado, con flexión de la cabeza y los muslos A nivel de L4-L5 3-5 ml. , fraccionado en varis tubos Citoquímico y citológico Aglutinación con latex Cultivo

33 UROCULTIVO Muestra de chorro medio, sonda transuretral, punción suprapúbica y con bolsa colectora Realizar aseo amplio con agua y jabón la zona periuretral La muestra debe ser procesada en 30 minutos 24-48 hr. Contaminación con m.o. periuretrales o perineales

34 CULTIVO DE EXUDADO FARINGEO
CON SIGNIFICADO CLÍNICO S. Pyogenes Haemophilus influenzae Corynebacterium diphtheriae S. Pneumoniae N. Meningitidis M. Catarrhalis N. gonorrhoeae S. agalactiae Muestra tomada con hisopos estériles e inocularse en medios de transporte semisólidos (Stuart)

35 TRANSPORTE DE MUESTRAS
Mantener la muestra tan próxima a su estado original como sea posible, con deterior mínimo, y minimizando el riesgo que afrontan quienes transportan la muestra, mediante el uso de recipientes herméticamente cerrados. MEDIO STUART DE TRANSPORTE Cloruro de sodio 3 g. Cloruro de potasio 0.2 g. Fosfato disódico 1.25 g. Trioglicato de sodio 1 g. Cloruro de calcio 10 g. Agar 4 g. Agua destilada 1 L

36 PREPARACIÓN DE MEDIOS ARTIFICIALES
Esterilización de los medios Condiciones óptimas de incubación Evaluación de la morfología de la colonia Coloración de Gram y subcultivos

37

38 CLASIFICACIÓN De acuerdo con su función y uso. Hay 3 categorías generales de medios: MEDIOS NO SELECTIVOS: Crecimiento con gran variedad de m.o., en corto tiempo Agar sangre, Agar chocolate, Agar Müller-Hinton MEDIOS SELECTIVOS: Contienen substancias que buscan inh. la mayoría de los m.o. Agar sal-manitol, Agar MacConkey, Agar sabouraud MEDIOS DIFERENCIALES: Agar sangre (efecto hemolítico),Agar salmanitol, Agar MacConkey (fermentación lactosa), Agar TSI (Producción ác. Sulfídrico), MIO

39 MEDIOS DE CULTIVO ARTIFICIALES
COMPONENTES OBJETIVO PRINCIPAL Agar chocolate Base de peptona, enriquecida con una solución de Hb al 2% Cultivos de especies de Haemophilus y especies patógenas de Neisseria Agar MacConkey Gram (+) son inhibidos por el cristal violeta y sales biliares. Rojo neutro como indicador Bacilos entéricos gram (-) fermentadores y no fermentadores Agar sangre Infusión de carne y corazón con 5% de sangre de carnero Requerimientos especiales, reacciones hemolíticas Agar XLD El desoxicolato de sodio inh. Los m.o. gram (+); rojo fenol indicador Especies de Salmonella y Shigella, de otros bacilos entérico gram (-) (amarillo) Agar salmanitol Base de peptona, manitol y rojo fenol indicador, sal al 7.5% Selectivo para estafilococos Agar SS Base de peptona con lactosa, rojo neutro indicador Salmonella y Shigella

40 COCOS GRAMPOSITIVOS CATALASA POSITIVOS
S. aureus S. epidermidis S. haemolyticus S. saprophyticus Especies de Micrococcus MEDIOS DE CULTIVOS DE ELECCIÓN.- Agar sangre o Agar chocolate Cultico selectivo: Agar manitol (halo amarillo) Incubación a 35° C x hr. COLONIAS S AUREUS: Medianas-grandes, elevadas, traslucidas; con pigmento amarillo, la mayoría betahemolíticas

41 COCOS GRAMPOSITIVOS CATALASA-NEGATIVOS
S. Betahemolítico (pyogenes) S. Pneumoniae S. Viridans Enterococos ( faecalis y fecium MEDIOS DE CULTIVO.- Agar sangre de oveja al 5% y agar chocolate Betahemolisis, es mejor en condiciones anaeróbicas Período de incubación 48 hr ASPECTO COLONIAS.- Translucida a opacas; planas, brillantes, ancho estrecho de betahemólisis

42 COCOS GRAMNEGATIVOS Moraxella catarrhalis N. gonorrhoeae
N meningitides MEDIO DE ELECCIÓN Agar sangre de carnero al 5% Agar chocolate Medios selectivos: Thayer Martin (agar chocolate + suplemento y antimicrobianos colistina, nistatina y vancomicina) Incubación a 35-37° C x 72 horas En una atmosfera húmeda enriquecida en CO2 ASPECTO DE LAS COLONIAS MC: Grande, no pigmentada o gris, opaca, lisa; consistencia friable NG: Pequeñas, blanco-grisaceas, convexas, translúcidas, brillantes.

43 BACILOS GRAMPOSITIVOS
Corynebaterium: Amycolatum Auris diphteriae Listeria monocytogenes MEDIOS DE CULTIVO Agar sangre de carnero al 5% Agar chocolate NO agar MacConkey Incubación a 35°C en 48 hr.-3 días Color negro gris

44 BACILOS Y COCOBACILOS GRAMNEGATIVOS
Burkholderia pseudomallei Burkholderia cepacia Pseudomona aeruginosa P. alcaligenes P. fluorescens P. luteola MEDIOS DE CULTIVO Agar sangre de oveja al 5% Agar chocolate Agar MacConkey, caldos de los sistemas de hemocultivo Incubación a 35° C en CO2 o aire atmosférico x horas >siembra COLONIAS.- Esparcidas, planas y con bordes dentados , brillo metálico, colonias betahemolíticas, pigmentación verde azulada

45 BRUCELLA Brucella abortus Brcella meltensis B. canis B. suis
Bacilos cortos o cocobacilos gramnegativos, inmóviles y aerobios; requieren CO2 MEDIOS DE CULTIVO Sistemas comerciales para hemocultivo (BACTEC, lisis-centrifugación) Incubación prolongada x 30 días Atmosfera humidificada con CO2 al 5-10% ASPECTO COLONIAS.- Pequeñas, convexas, lisas, traslúcidas no hemolíticas, amarillo pálido

46 MICOBACTERIUM M. tuberculosis M. Bovis BCG M. Bovis M. africanus
M. No tuberculosas Complejo M. avium M. Simiae M. Celatum M. fortuitum Bacilos inmóviles muy delgados Ácido-alcohol resistentes MEDIO DE CULTIVO.- Se requiere la combinación de medios de cultivo sólidos líquidos SOLIDOS: Lowenstein-Jensen. 35° C en la obscuridad con una atmosfera con 5-10% de CO2 y humedad elevada x 3-6 semanas Agar chocolate LÍQUIDOS: BACTEC. Atmosfera 5-10% de CO2 x 1º días

47 LA BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

48 INMUNOFLUORESCENCIA

49 Introducción Costoso Mucho tiempo
No siempre se pueden aislar los microorganismos Genotipo Dx microoganismos de difícil cultivo Mycobacterias y Legionella ID secuencias de DNA

50 Dx. Biología Molecular Análisis de DAN o RNA
Detección de segmentos dentro de otros no específicos Enzimas de restricción DNA varios millones fragmentos RNA 1/1000 Electroforesis en gel Hibridación con sonda para ID mol. interés

51 Proceso ID gen especifico del microorganismo Segmentos cortos
Iniciadores para amplificación PCR Hibridación de segmentos complementarios Segmentos largos Sondas

52 Hibridación con Sondas
ADN o ARN Muestras clínicas o Cultivos In situ en céls. En laminillas en el microscopio Común fijados en formalina y embebidos en parafina

53 Southern blot Ed southern años 70
Enzima Organismo Sitio de rotura 5´ 3’ Bam HI Bacillus amyloliquefaciens H G * GATCC Eco RI E. Coli RY 13 G * AATTC HaeIII H aegyptus GG * CC Hind III H. Influenzae Rd A * AGCTT Hpa I H. Parainfluenzae GTT * AAC Pst I Providencia stuartii CTGCA * G Sma I Serratia marcescens CCC * GGG Sal I Strptomices albus G G * TCGAC Ed southern años 70 Analisis fragmentos de DNA generados por enzimas de restricción

54 Southern blot Enzima de restricción Separación por electroforesis
Gel de agarosa Desnaturalización Filtro nitrocelulosa (transparencia y capilaridad) Incubación del filtro Hibridación Exposición a rayos X o a película sensible a la luz

55 Aplicaciones Aplicación Organismo
Detección directa de muestras clínicas Chlamydia trachomatis Streptococcus del grupo A Papilomavirus Neisseria gonorrhoeae Confirmación de cultivos Coccidioides immitis Haemophilus influenzae Histoplasma capsulatum Mycobacterium tuberculosis complex Listeria monocitogenes

56 Northern blot Determinar tamaño y abundancia de mRNA derivado de un determinado gen No enzimas de restricción Longitud por exones

57 Amplificación de Secuencias de DNA
PCR Alternativa a la clonación Miles de millones de copias en pocas horas Iniciadores específicos de genes cuya secuencia es conocida Alta sensibilidad Reacción cruzada 1 trepano-inmediato CMV 23S E. Coli Inhibidores de la polimerasa

58 PCR Amplificación enzimática de un fragmento de DNA diana
Desnaturalización con calor Cebadores cadenas complementarias DNA polimerasa 2 nuevas cadenas Repetidos ciclos

59 Amplificación por PCR Termociclador NASBA TMA Simultaneo
Desnaturalización de las cadenas de ADN Hibridación de los iniciadores Extensión de la secuencia amplificada Termociclador NASBA TMA Simultaneo PCR - multiplex LCR (Ligasa Chain Reaction) Hibridación con sondas especificas Amplificación de las sondas Ligamiento Producir cadenas duplicadas PCR-RT

60 PCR Cuantitativa Cantidad de DNA concreta existente en una muestra
Se duplica x cada ciclo Seguimiento fases iniciales Umbral arbitrario PCR tiempo real

61 Marcación Enzimática Radioactiva Quimioluminiscente Fluorescente
Cualitativa Cuantitativa Multiplicación de la señal Reacción Secuencia blanco Sondas Señal

62 Pruebas de PCR y PCR-RT Organismo Nombre de la prueba Método
Limite de detección Aplicación HIV 1 Amplicor PCR <100 copias/ml Prueba confirmatoria Monitor PCR cuantitativo 400 – 750,000 copias/ml Cuantificación durante terapia HCV 200 – 10,000,000 copias/ml M. Tuberculosis >20 organismo/RXN Pacientes no tratados y baciloscopia + C. Trachomatis 10-20 cuerpos elementales/RXN Confirmación y monitoreo Enterovirus No reportado VHC Quantiplex DNA ramificado 200, x106 copias/ml VHB .7x x106 copias/ml N. gonorrhoeae LCX LCR