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TRANSFORMACIÓN. CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA INTRODUCCIÓN DE UN DNA EXÓGENO Puede ser NATURAL (se han encontrado aproximadamente.

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1 TRANSFORMACIÓN

2 CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA INTRODUCCIÓN DE UN DNA EXÓGENO Puede ser NATURAL (se han encontrado aproximadamente 40 especies que pueden realizar este proceso) ARTIFICIAL (INDUCIDA)

3 TRANSFORMACIÓN ¿Para qué tomar DNA exógeno?.... Grandes maquinarias proteícas intervienen en el proceso de transformación Algunas hipótesis que no son excluyentes….. I.Para la diversidad genética ( por ejemplo: obtener resistencia a antibióticos ) II. Para la reparación de DNA III. Como nutrientes: El DNA es fuente de carbono, nitrógeno y fósforo

4 SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS TRANSFORMACIÓN vs CONJUGACIÓN ¿existe DNA libre en todos los ambientes, es estable?

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6 TRANSFORMACIÓN NATURAL, las bacterias más estudiadas son ETAPA 1: Desarrollo de un estado competente ETAPA 2: Procesamiento del DNA Unión Importe Recombinación GRAM + Streptococcus pneumoniae Bacillus subtilis GRAM - Neisseria gonorrhoeae Haemophilus influenzae El proceso de transformación se puede dividir en 2 ETAPAS

7 Etapa 1: Desarrollo de un estado competente ¿Qué es una célula competente? Estado fisiológico inducible Factores que inducen el estado de competencia en la transformación natural: Limitación en los nutrientes Alta densidad celular Temperatura, pH La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de competencia Velocidad de transferencia: nucleótidos/segundo a 30°C

8 La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de competencia

9 Una vez que ingresó el DNA de cadena sencilla ¿qué ocurre dentro de la célula? ¿DE MANERA NATURAL es fácil intercambiar plásmidos entre bacterias por transformación? ¿es más fácil por conjugación?

10 TRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL El caballito de batalla es la bacteria Escherichia coli Es una técnica fundamental en biología molecular: clonación y generar organismos transgénicos

11 TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR VECTORES GENÉTICOS: molécula de DNA que es usada como vehículo para transportar segmentos de DNA foráneo en una célula huésped,

12 PLÁSMIDOS

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14 OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A KANAMICINA Medio LB + KANAMICINA Escherichia coli

15 En la transformación artificial ¿cómo se induce el estado competente de una bacteria? 1. Tratamiento químico

16 E. coli Preparar células competentes de E. coli 3 mL medio Luria Incubar toda la noche a 37°C E. coli A= 0.6 – 0.8 a 600 nm

17 5000 r.p.m. 5 min 4°C 3 mL NaCl Resuspender 5 mL CaCl 2 Resuspender E. coli Preparar células competentes de E. coli Incubar 20 min 2500 r.p.m 7 min CÉLULAS COMPETENTES

18 1 hr 42°C 70 s Inmediatamente en hielo 1 mL medio SOC Incubar a 37°C con agitación por 45 min LA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICO

19 CÉLULAS COMPETENTES PLÁSMIDO: DNA EXÓGENO Buffer TE, CaCl 2 y PLÁSMIDO

20 Al final de la transformación

21 Utilizaremos el plásmido pET-TEM Sitio múltiple de restricción Origen de replicación Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina fosfotransferasa

22 Células transformantes Células no transformantes Medio Luiria + KANAMICINA

23 ESQUEMA GENERAL SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina


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