Microbiología Clase 1 Introducción a la microbiología Bioq. Denise Risnik (drisnik@hotmail.com)

Definición La microbiología es la ciencia encargada del estudio de los microorganismos, seres vivos pequeños no visibles al ojo humano (del griego  mikros "pequeño",  bios, "vida" y logía, ciencia), también conocidos como microbios. Se dedica a estudiar los organismos que son sólo visibles a través del microscopio: organismos procariotas y eucariotas simples. Son considerados microbios todos los seres vivos microscópicos, estos pueden estar constituidos por una sola célula (unicelulares), así como por un conjunto de células indiferenciadas (Multicelulares), estos pueden ser eucariotas (células con núcleo y organelas) tales como hongos y protistas o procariotas (células sin núcleo definido) como las bacterias.

Dentro de la Microbiología se agrupan la bacteriología, parasitología, micología y virología Si bien la microbiología abarca una gran variedad de organismos muy diferentes, las técnicas para cultivarlos, identificarlos y estudiarlos son semejantes.

Célula eucariota

Célula procariota

Comparación

Comparación

Parasitología

Parasitología Dominio: Eukarya Animales invertebrados metazoos y protozoarios unicelulares Variedad muy grande de especies agrupados en función de la patología que producen y no por sus características estructurales. Ej: Mosquitos, vinchucas, ladillas, piojos, gusanos chatos y redondos (visibles a simple vista) y protozoos unicelulares microscópicos. Distribución endémica-regional Complejos ciclos biológicos con mas de un huésped

Micología

Micología Dominio: Eukarya Grandes (parasitan plantas), medianos (setas, champignones) pequeños (Mohos filamentosos) y Levaduras (unicelulares) Compuestos por hifas Pueden presentar Dimorfismo Pocas especies infectan humanos No integran la microbiota habitual humana Mayor importancia en inmunocomprometidos

Virología “Especies” particuladas (no mas de 120 nm) sin ninguna organización celular, que solo pueden multiplicarse dentro de células (procariotas o eucariotas) utilizando el sistema energético y biocinética de estas. No hay especie viva investigada en la que no se haya determinado la presencia de un virus Están compuestos por material genético y una estructura proteica

Virología

Priones Un prion es una partícula infecciosa formada por una proteína denominada priónica, que produce enfermedades neurológicas degenerativas transmisibles tales como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y la encefalopatía espongiforme bovina La proteína tiene alterada su estructura secundaria, teniendo un incorrecto plegamiento de su estructura terciaria.  A diferencia del resto de los agentes infecciosos (virus, bacterias, hongos etc...), que contienen ácidos nucleicos, un prion solamente esta compuesto por aminoácidos y no presenta material genético. Dichas proteínas mutadas forman agregados supramoleculares y son patógenas con plegamientos anómalos ricos en láminas beta, y autoreproducibles.

Bacteriología

Bacteriología Dominio bacteria Células Procariotas Todas UNICELULARES Existe un numero muy grande de especies de las cuales muy pocas (en forma relativa al total) producen patología humana Un numero muy importante de bacterias (aerobias y anaerobias) integran la microbiota habitual humana Replicación por fisión binaria Pared celular de Mureína (hay excepciones)

Morfología

Tamaños

Microbiología clínica Es una disciplina aplicada de la medicina que estudia los microorganismos capaces de provocar enfermedades en los seres vivos. Importante: No todos los microorganismos son patógenos. Dependiendo del huésped y las circunstancias pueden ser beneficiosos, perjudiciales o neutrales.

Postulados de Koch (1884) Para probar la relación causal entre un microorganismo y una enfermedad específica El microorganismo debe estar presente en cada caso de la enfermedad, pero ausente en organismos sanos. El microorganismo sospechoso debe ser aislado y obtener un cultivo puro La misma enfermedad se debe producir cuando el microorganismo aislado es inoculado en un hospedador sano. El mismo microorganismo debe ser aislado otra vez del hospedador inoculado enfermo

Técnicas Observación de frescos Tinciones Cultivos Pruebas bioquímicas Pruebas de sensibilidad Anamnesis

Tinciones Tinción de Gram: Utilizada como método de clasificación de las bacterias en dos grandes grupos: Gram + y Gram – Se basa en las características de la pared celular Gram Positivo: Violeta Gram Negativo: Rosa

Tinción de Gram

Tinción de Gram

Tinción de Gram

Ziehl Neelsen Tinción para bacterias acido alcohol resistentes Principal uso: Detección de Mycobacterium tuberculosis (agente causal de la tuberculosis)

Cultivos

Cultivos Las sustancias nutritivas preparadas en el laboratorio para el crecimiento de microorganismos se conocen como medio de cultivo. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras necesitan medios especiales y aún hay algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios inertes desarrollados hasta ahora. Los microbios que crecen y se multiplican dentro o sobre un medio de cultivo constituyen lo que se denomina cultivo microbiano. En éste los gérmenes desarrollan sus procesos bioquímicos vitales.

Cultivos INÓCULO: Introducción de células bacterianas viables en un medio de cultivo líquido o sobre la superficie de un medio sólido. CULTIVO: Se llama de esa manera a un conjunto o población de bacterias que crecen en un medio determinado. Si es homogénea hablamos de un cultivo puro (población de la misma cepa de la misma especie). COLONIAS: Pequeñas masas visibles que forman las bacterias diseminadas mecánicamente sobre la superficie de un medio sólido cuando se replican en un tiempo determinado. CLON: Cuando las bacterias de una colonia derivan de una única célula. UFC: Puede estar compuesta por una bacteria o un cúmulo de bacterias y al crecer sobre medio sólido son capaces de generar una colonia aislada.

Cultivos Todos los medios de cultivo deben reunir una serie de condiciones: Deben contener agua : componente por excelencia de la célula bacteriana. Disolvente de las sustancias nutritivas y además es el solvente de los electrolitos que mantienen el equilibrio ácido-base y la presión osmótica bacteriana. Deben contener sustancias nutritivas adecuadas : hidratos de carbono, proteínas, lípidos, sales minerales, y en algunos casos vitaminas o factores de crecimiento que son sustancias indispensables para acelerar el metabolismo bacteriano y actuar como coenzimas de procesos enzimáticos. Debe tener un pH adecuado: pH neutro ligeramente alcalino (la mayoría de las bacterias se desarrollan a pH entre 6,5 (acidófilos) y 7,5 (neutrófilos)). Debe mantenerse en condiciones estériles: para evitar que se desarrollen gérmenes no deseados dificultando identificar la bacteria que hemos sembrado.

Cultivos Para gérmenes aeróbicos: el medio de cultivo debe disponer de oxígeno libre o combinado, según que las bacterias respiren por un mecanismo aerobio, anaerobio facultativo o microaerofílico. Aceptores y donadores de hidrógeno: todos los organismos requieren una fuente de energía en forma de donantes de hidrógenos (sustratos oxidables).También se requieren aceptores de hidrógeno en las reacciones de oxidorreducción que suministran energía. - Gérmenes aerobios: oxígeno libre - Gérmenes anaerobios estrictos: Sust. Inorgánicas (carbonatos, nitratos, sulfatos) - Gérmenes anaerobios facultativos: Sust. Orgánica (fermentadores). Fuente de Carbono, Nitrógeno y minerales (Azufre, Fósforo, etc.) Debe ser mantenido a una temperatura óptima: ésta temperatura esta alrededor de los 37º C. Hay una gran variedad de medios disponibles para el cultivo de microorganismos. Comercialmente la mayoría de ellos tienen sus componentes previamente mezclados y sólo necesitan la adición de agua y esterilización.

Medios de cultivo El agar es una sustancia gelatinosa, extraído de algas, muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviente  y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Diferencia entre un medio de cultivo sólido y uno líquido: El medio de cultivo sólido contiene entre 1.5 y 2% de agar-agar; el medio líquido no contiene agar-agar Los medios sólidos se utilizan principalmente para aislar y visualizar colonias Los medios líquidos son buenos para un desarrollo abundante

MEDIOS PARA AISLAMIENTOS PRIMARIOS Generales No Selectivos para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc) Selectivos: Se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina).Contienen uno o varios compuestos que inhiben el crecimiento de un determinado tipo de microorganismos y no afectan a otros tipos. Ej: El cristal violeta inhibe las gram+ Enriquecidos: Algunos microorganismos no son capaces de desarrollarse en medios de cultivo normales. Para cultivarlos necesitamos añadir sustancias altamente nutritivas como sangre, suero, extractos de tejidos animales. Estos medios son los medios enriquecidos, y los microorganismos que crecen en ellos son microorganismos exigentes o fastidiosos.  Suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado . Para Aislamientos Especializados:  formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación

Medios para identificación Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas  específicas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier  bacteria. Contienen distintos compuestos químicos o indicadores sobre los que determinados microorganismos adquieren coloraciones específicas o reaccionan de una manera particular. Ejemplo: Agar levine tiene colorantes especiales (eosina y azul : a las colonias que viven en el medio.  Escherichia coli : forma colonias de color verde claro, Enterobacter  : forma colonias de color rosa/salmón. Medios Selectivos Y Diferenciales: Es un medio específico para enterobacterias. Cristal violeta inhibe a las gram +. Las sales biliares hacen que sólo se desarrollen las gram – (tolerantes) (las enterobacterias.) El indicador es el rojo neutro, que es rojo a pH ácido e incoloro a pH básico. Como fuente de carbono se utilizan peptona y lactosa. Ejemplo: Agar McConkey tiene cristal violeta y sales biliares. Se usa para detectar  E. Coli y Salmonella  E. Coli fermenta  la lactosa liberando ácidos, por lo que se crea un medio ácido y el indicador se pone rojo. Salmonella no fermenta la lactosa, por lo que no formará ácidos y formará colonias incoloras

Agar sangre AGAR SANGRE: Medio enriquecido, estándar. El AS al 5% con base de Tripticasa-Soja es un medio que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias. Permite clasificar microorganismos por su capacidad de hemolisis ayudando a su identificación

Agar chocolate Medio enriquecido, para bacterias que no crecen en medios habituales. El Agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de gonococos y meningococos, pero en el que pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. Con un medio análogo a éste es con el que Thayer y Martin han hecho sus primeros asilamientos selectivos de  gonococos, después de añadir antibióticos

Agar Mac Conkey Este medio es selectivo ya que la concentración de sales Biliares inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram +. Se incluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram +, especialmente estafilococos y enterococos. Tambien diferencia microorganismos fermentadores de lactosa.

Agar EMB Levine Medio adecuado para la búsqueda y diferenciación de bacilos entéricos. Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias. La combinación utilizada de eosina y azul de metileno, inhibe el desarrollo de microorganismos Gram + y de bacterias Gram - fastidiosas, y también, permite diferenciar bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa.  Fermentadores de lactosa: verde con brillo metálico. No fermentadores de lactosa: incoloras

Pruebas bioquímicas

Pruebas bioquímicas Serie de pruebas que permiten la identificación de una bacteria a partir de un cultivo puro. Están tabuladas Partiendo de un determinado medio de cultivo selectivo y/o diferencial y conocimientos de bacteriología fisiopatológicos, se puede reducir el numero de pruebas bioquímicas necesarias.

Pruebas de sensibilidad Su función es la elección del tratamiento antibiótico adecuado Existen varios tipos El mas usado es el antibiograma por difusión en placa Se utiliza el conocimiento sobre la bacteria y el lugar de infección para ensayar el menor numero de antibióticos posible

Pruebas de sensibilidad

Técnica aséptica

Bioseguridad

Algunas definiciones ESTERILIZACIÓN: Es la destrucción o eliminación completa de toda forma de vida microbiana. Puede llevarse a cabo por procesos físicos o químicos (vapor a presión, calor seco, óxido de etileno, líquidos químicos). DESINFECCIÓN: Es un proceso que elimina la mayoría o todos los microorganismos sobre los objetos inanimados con la excepción de esporos bacterianos. Se efectúa por medio de agentes químicos. GERMICIDA: Agente que destruye microorganismos en especial patógenos, en tejidos vivos y objetos inanimados. Según germen sobre el que actúa, se lo denominará fungicida, virucida, bactericida, etc.. ANTISÉPTICO: Sustancia aplicada en la piel u otro tejido vivo que previene o detiene el crecimiento o la acción de microorganismos por inhibición de su actividad o por su destrucción. LIMPIEZA: Es la remoción física de materia orgánica o suciedad de los objetos. Generalmente se realiza utilizando agua, con o sin detergentes.

Esterilización Calor: Tanto el húmedo como el seco esterilizan, pero el calor seco destruye con una velocidad más lenta y requiere temperaturas más altas y tiempos de exposición más prolongados. Esterilización por calor seco (estufa): Este método utiliza aire caliente seco. Ventajas: facilidad de instalación, facilidad de manejo y facilidad de poder esterilizar material dentro de recipientes cerrados. Desventajas: Son necesarias altas temperaturas, con lo cual los instrumentos a esterilizar pueden ser deteriorados por el excesivo calor, no distribución homogénea de la temperatura y excesivo gasto de funcionamiento por consumo de energía eléctrica. Esterilización por calor húmedo (Autoclave): Actúa de manera combinada el calor y la presión. El calor húmedo es producido en forma de vapor de agua a presión y el mecanismo de la destrucción se realiza a través del mecanismo de la coagulación de la proteína bacteriana, destruyendo los microorganismos más resistentes como las esporas.

Esterilización Óxido de etileno: El óxido de etileno es un agente alquilante ampliamente utilizado en la esterilización gaseosa. Es activo contra todo tipo de bacterias, incluyendo esporas, virus y bacilos tuberculosos. Es utilizado para todo aquel material termolábil o que no resista las condiciones de esterilización por calor húmedo o seco. Ej.: plásticos, goma, equipo electrónico. Es mutagénico, tóxico, la inhalación causa náuseas, vómitos y trastornos neurológicos, a igual que cualquier otro tipo de gas, es inflamable y de riesgo cuando su utilización no se realiza adecuadamente, bajo condiciones controladas y por personal competente.

Equipos para Estrilización

Bibliografía Recomendada Microbiología biomédica. Basualdo Microbiología. Brock Muchas Gracias!!