INFECCION POR HHV6 EN TRANSPLANTADOS RENALES: UNA CONTROVERSIA EN EL DIAGNOSTICO Julieta Giménez Carolina Carrizo

Introducción Infection with Herpesvirus 6 after Kidney-Pancreas Transplant Benito N. et al, American Journal of transplantation 2004; 4:1197-1199 Hombre, 29 años Enfermedad renal terminal por complicación de DBT tipo I Serología pre-Tx Positivo Negativo CMV HSV VZV EBV HHV-6 Treponema palidum Toxoplasma gondii HCV HBV HIV Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:1197-1199

Caso Clínico El procedimiento quirúrgico se realizó sin inconvenientes Profilaxis: Trimetoprima – sulfametoxasol Ganciclovir Alta 13 días post-trasplante Crea 1.3 mg/dl y Glu: 73 mg/dl Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:1197-1199

Progresión a normalizar las Ez Caso Clínico Días post-Tx GB (cel/mm3) Hb (mg/dl) Plq (/mm3) 17 22 34 61 9100 10.5 145000 3100 - 100 7 M U E R T AST (UI/ml) ALT (UI/ml) FAL (UI/ml) GGT (UI/ml) 122 222 317 92 864 1153 1186 416 Progresión a normalizar las Ez Cultivos sangre y orina LCR Sangre Otros pp65 (-) Biopsia Hp HHV-6 por PCR Serologías Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:1197-1199

HHV-6 Generalidades Familia Herpesviridae, subgrupo Betaherpesvirinae DNA lineal doble cadena (160-162 Kb) Nucleocápside icosahédrica (90-100 nm) Envoltura glicoproteica Variantes A y B (90% de homología) De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245

CD46: en todas las células nucleadas HHV-6 Generalidades CD46: en todas las células nucleadas Tropismo celular: Cerebro Glándulas salivales Hígado Endotelio Monocitos Células progenitoras de MO LATENCIA De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245

HHV-6 Generalidades Infección primaria Niñez (6 meses – 1 año) 20% Sexta enfermedad Reinfección o reactivación en huesped inmunocomprometido Trasplantados Organo Sólidos (TOS) – Incidencia 32 % Trasplantados de Médula Osea (TMO) – Incidencia 48 % Reinfección o reactivación en huesped inmunocompetente De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245

Pruebas Diagnósticas IFI Serología ELISA Cultivo convencional Aislamiento Cultivo convencional Shell vial (cultivo rápido) PCR Cualitativa (linfocitos o plasma) Semicuantitativa Cuantitativa Cuantitativa en tiempo real Antigenemia Detección de Ag específicos en células mononucleares de sangre periférica Inmunohistoquímica (IHC) p101 (HHV-6B) gp82 (HHV-6A) Benito N. et al; Enferm Infecc Microbiol Clin 2003;21(8):424-32

Serología Permite la detección de infección latente o seroprevalencia Población adulta > 90% seropositivos Infección primaria:  4 veces IgG IFI ó  1.6 veces IgG EIA Dockrell et al, Transplantation 1999 Lautenschlager et al, Clin Infect Dis 1998 Saxinger et al, J Virol Methods 1988 La detección de IgM es más controversial ya que puede producirse tanto en infecciones primarias como en reactivaciones Dockrell et al, Transplantation 1999 Desventajas: NO DISTINGUE ENTRE VARIANTES NO ES DE UTILIDAD EN PACIENTES INMUNOSUPRIMIDOS

Aislamiento viral Cultivo convencional: Cocultivo de linfocitos del paciente con linfocitos de sangre de cordón umbilical activados y tratados con IL-2 Técnica laboriosa (5 – 21 días) Singh et al, Ann Inter Med 1996 Shell Vial: Cultivo primario en fibroblastos humanos que permite la detección de antígeno viral a las 24 - 72 hs. Singh et al, Ann Inter Med 1996 Singh et al, Transplantation 1997

PCR Técnica rápida Elevada Sensibilidad PCR cualitativa Valor limitado en la correlación clínica y la infección activa Secchiero et al, J Infect Dis 1995 Singh et al, Ann Inter Med 1996 Dockrell et al, Rev Med Virol 2001 PCR cuantitativa, en tiempo real y multiplex PCR Permite detectar infección activa y distinguir entre variantes Secchiero et al, J Clin Microbiol 1995 Kidd et al, J Virol Methods 1998 Emery et al, Clin Infect Dis 2001 Gautheret –Dejean et al, J Virol Methods 2002

Resumen - + +/- ++ ++++ Latencia Infección Activa Célula no infectada Célula infectada productiva  Respuesta a la terapia Reactivación Expansión     Latencia Infección Activa Aislamiento viral - + PCR cualitativa plasma PCR cualitativa leucocitos +/- PCR cuantitativa leucocitos ++ ++++

Frecuencia de HHV-6 post Tx de MO Método Muestra n Inf. activa (%) Estudio PCR PCR,IHC qPCR Cultivo GB y BAL GB y plasma GB GB, orina y saliva GB y piel GB y LCR 41 92 22 61 37 57 74 20 82 26 25 46 42.5 60 28 ND 78 38 48 Takatsuka et al (2003) Imbert-Marcille et al (2000) Maeda et al (1999) Chan et al (1997) Wang et al (1996) Wilborn et al (1994) Appleton et al (1995) Ljungman et al (2000) Cone et al (1999) Yoshikawa et al (2002) Yoshikawa et al (2001) Kadakia et al (1996) Yoshikawa et al (1991) ND: no determinado De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245

Frecuencia de HHV-6 post Tx renales y renopancreáticos Método Muestra n Inf. activa (%) Estudio PCR qPCR PCR, Serología Cultivo, Serología GB Orina y suero 107 52 30 32 65 ND 23 50 31 55 Pacsa et al (2003) Kidd et al (2000) Ratnamohan et al (1998) Herbein et al (1996) Yoshikawa et al (1992) ND: no determinado De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245

TEST DIAGNÓSTICO DE REFERENCIA ? TEST DIAGNÓSTICO DE REFERENCIA para detectar infección por HHV-6 Volin et al, British Journal of Hematology, 2004

UN MÉTODO DE CULTIVO PARA DIAGNÓSTICO DE HHV-6

Objetivos Realizar Shell vial para detectar HHV-6 en pacientes trasplantados Procesar las muestras de plasma y leucocitos de los mismos pacientes mediante Nested PCR

Pacientes trasplantados Materiales y Métodos Total de muestras: 31 Leucocitos (obtenidos por dextran) 31 Plasma Pacientes trasplantados (15) Renales (13) Renopancreáticos (2) Serología IgG HHV-6 : 14 (+), 1 (-) Antigenemia pp65 : 15(-)

Pacientes trasplantados Diagrama de trabajo Muestras de Pacientes trasplantados Leucocitos Shell vial Nested PCR Plasma

previamente acondicionados Materiales y Métodos Shell Vial 200 ul de leucocitos previamente acondicionados Centrifugación 1 h – 2200 rpm 37º C 48 hs 1) Células de fibroblastos humanos crecidas en forma de monocapa Presencia de Antígeno AcMo ARGENE 2) IFI Ac Antiratón marcado

Materiales y Métodos Nested PCR 1) Extracción de ADN Columnas comerciales (Qiagen) 1er producto de amplificación 520 pb 2do producto de amplificación 258 pb Termociclador: Abbot LCX 2) Amplificación 3) Electroforésis 258 pb Secchiero et al. J Infect Dis.1995;171:273-80

1º Producto de amplificación (520 pb) Nested- PCR Secuencia Target Primer Ext. 1º Producto de amplificación (520 pb) Primer Int. 2º Producto de amplificación (258 pb) Sensibilidad : 0.012 DICT 50 / ml

Nested- PCR Muestra: Plasma Gel de agarosa 2% 258 pb

Detección de HHV-6 en Tx

Paciente 1 Sexo masculino, 54 años Causa de Tx: Insuficiencia Renal Crónica secundaria a poliquistosis (desde 35 años) Transplante renal con donante vivo relacionado NEGATIVO POSITIVO Serología pre-Tx ND CMV, HSV I y II, EBV CMV HCV, HBV, HIV , HHV-6 Donante Receptor ND: no disponible

Paciente 1 El paciente evoluciona favorablemente Se lo controla por consultorio externo a partir de la 2da semana pos-Trasplante Sin datos clínicos relevantes

CONCLUSIONES 1- La frecuencia de detección de HHV-6 en leucocitos por PCR fue de 11/25 (44%), esto sugeriría infección activa en 5 de los pacientes estudiados 2- La PCR en plasma fue negativa en todos los pacientes y no se encontraron síntomas clínicos asociados a enfermedad por HHV-6 3- En 1/25 (4%) el Shell vial fue positivo con PCR positiva en la misma muestra. Correspondería a un paciente que adquirió infección primaria pos-trasplante. Esto no se correlacionó con enfermedad

CONCLUSIONES 4- El Shell vial es una alternativa complementaria a las técnicas moleculares para detectar la infección activa por HHV-6 5- Son necesarios estudios en forma longitudinal y prospectiva con mayor número de pacientes evaluandolos a diferentes tiempos Pos-Trasplante con el fin de definir un algoritmo diagnóstico para la infección activa por HHV6.

Agradecimientos Dra en Biología Cristina Videla Bioq. Alfredo Martínez Dra en Biología Cristina Videla Servicio de Virología (CEMIC)

¡ MUCHAS GRACIAS !