PRIMERA INVESTIGACIÓN ARGENTINA DE ENFERMEDADES GENÉTICAS PEROXISOMALES: Avance en la Identificación Grupal y Desarrollo Metodológico para la Individuación Patológica Becaria Lic. Silvina Edith Bender Directora Dra. Raquel Dodelson de Kremer CEMECO Centro de Estudio de las Metabolopatías Congénitas

ENFERMEDADES GENÉTICAS PEROXISOMALES (EGP) ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO Sindrome de Zellweger (SZ) Adrenoleucodistrofia Neonatal (ALDN) Enfermedad de Refsum Infantil (ERI) Defectos de la Biogénesis Peroxisomal Condrodisplasia Rizomélica Puntata (CDRP I) Deficiencias Enzimáticas Aisladas Pseudo Zellweger (ALD-X) Adrenoleucodistrofia Ligada al Cromosoma X Enfermedad de Refsum Clasica (ERC) Pseudo Adrenoleucodistrofia Hiperoxaluria (HO) Deficiencia de Proteína Bifuncional Deficiencia de AcilCoA-Oxidasa (DPBF) (P-SZ) Acidemia Pipecólica Neonatal (ALDN)

ENFERMEDADES GENÉTICAS PEROXISOMALES (EGP) CONSECUENCIA METABÓLICA  -oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga, ácido pristánico, ácido trihidroxico- lestanoico y cadenas laterales del colesterol Síntesis de ácidos biliares, plasmalógenos e isoprenoides α- oxidación del ácido fitánico Catabolismo de poliaminas, ácido L-pipecólico y H 2 O 2 Metabolismo de glioxilato prostaglandinas, etanol y gluconeogenesis FUNCIONES PEROXISOMALES ácidos grasos de cadena muy larga ácido trihidroxi- colestanoico ácido pristánico colesterol plasmalógenos ácido fitánico ácido pipecólico oxalato MARCADORES BIOQUÍMICOS

 Integrar los objetivos hacia la “Investigación Trasnlacional”; colaboración entre investigadores clínicos, laboratorios y pacientes para propugnar que los descubrimientos sean translacionales a la práctica asistencial y promover enérgicamente la Investigación Clínica en Genética Médica como herramienta básica para el progreso en el cuidado de la Salud. OBJETIVOS GENERALES DEL PROYECTO  Continuar con el desarrollo del temario seleccionado en el campo de la Genética Médica-Bioquímica, área de Enfermedades Genéticas Peroxisomales (EGP), graves patologías neurodegenerativas previamente no abordadas en nuestro país.  Contribuir a la difusión y utilización de un centro referencial en el país destinado a la contención del paciente, su familia y la sociedad, tendiente a disminuir el enorme impacto humano y económico que provoca la falta de diagnóstico en estas patologías.

OBJETIVOS ESPECIFICOS DEL PROYECTO I.Desarrollar la metodología bioquímica diagnóstica, destinada a la definición nosológica exacta de cada una de las entidades del amplio grupo de las EGP (Algoritmo Bioquímico). II.Estudiar biomarcadores secundarios a las EGP, perfil de ácidos orgánicos urinarios y análisis molecular de polimorfismos, involucrados en la extraordinaria variación fenotípica interfamiliar e intrafamiliar. (focalización: ALD-X) III.Estandarizar los métodos para la medición de los metabolitos diagnósticos en muestras de sangre impregnadas en papel de filtro. (sensibilidad, reproducibilidad y estabilidad).

ALGORITMO BIOQUÍMICO PROPUESTO EXACTA DEFINICIÓN NOSOLÓGICA AGCML PLASMÁTICOS AUMENTADONORMAL Excluye Defecto de  -Oxidación y DBP Estudios Histométricos Peroxisomales, Determinaciones Enzimáticas y Análisis Molecular ANORMAL NORMAL Probable Deficiencia de DPBF o Tiolasa Peroxisomal PLASMALÓGENOS ERITROCITAROS DISMINUÍDO ÁCIDO FITÁNICO PLASMÁTICO Probable Defecto de  - Oxidación/ Otras Conrodisplasias DBP/CDRP NORMAL AUMENTADO CDRP Tipo II y Tipo III Probable Deficiencia de Acil CoA-Oxidasa RELACIÓN PRISTÁNICO/FITÁNICO NORMAL AUMENTADO Probable DBP NORMAL AUMENTADO INTERMEDIARIOS DE AC. BILIARES (DHCA Y THCA) DBP DPBF Tipo B Deficiencia de Acil CoA-Oxidasa AUMENTADO NORMAL ALD-X CDRP Tipo I ACIDOS ORGÁNICOS URINARIOS

ALGORITMO BIOQUÍMICO PROPUESTO EXACTA DEFINICIÓN NOSOLÓGICA AGCML PLASMÁTICOS AUMENTADONORMAL Excluye Defecto de  -Oxidación y DBP Estudios Histométricos Peroxisomales, Determinaciones Enzimáticas y Análisis Molecular ANORMAL NORMAL Probable Deficiencia de DPBF o Tiolasa Peroxisomal PLASMALÓGENOS ERITROCITAROS DISMINUÍDO ÁCIDO FITÁNICO PLASMÁTICO Probable Defecto de  - Oxidación/ Otras Conrodisplasias DBP/CDRP NORMAL AUMENTADO CDRP Tipo II y Tipo III Probable Deficiencia de Acil CoA-Oxidasa RELACIÓN PRISTÁNICO/FITÁNICO NORMAL AUMENTADO Probable DBP NORMAL AUMENTADO INTERMEDIARIOS DE AC. BILIARES (DHCA Y THCA) DBP DPBF Tipo B Deficiencia de Acil CoA-Oxidasa AUMENTADO NORMAL ALD-X CDRP Tipo I ACIDOS ORGÁNICOS URINARIOS

METODOLOGÍA BIOQUIMICA Ac. Orgánicos Urinarios (AOU) Orina 5 ml Cromatografía Gaseosa Capilar-Ionización a la llama (CG-FID) Ac. Grasos de Cadena muy Larga (AGCML) Ac. Grasos Ramificados (AGR) Plasma 250 µl Metabolitos Primarios Biomarcadores Secundarios

METODOLOGÍA DEL ANÁLISIS MOLECULAR Polimorfimos del Metabolismo de la Metionina Parámetros no convencionales a las EGP Sustitución 677C>T de la MTHFR Inserción 844ins68 de la CBS Digestión de producto de PCR con enzima de restricción HindI. Electroforesis en gel de poliacrilamida 6% (Frosst 1995) Separación de productos de PCR por electroforesis en gel de agarosa 3%. El alelo “wild type” produce un fragmento de 596 pb y la insersión uno de 664 pb. (Urreizti 2003) 5,10-Metilenetetrahidrofolato Reductasa (MTHFR) Cistationina Beta-Sintasa (CBS) Mayor vulnerabilidad desmielinización Efecto protector desmielinización

INTEGRACIÓN DEL ALGORITMO BIOQUÍMICO A LA COMPATIBILIDAD CLÍNICA Evaluación Clínica Clasificación Fenotípica de ALD-X Fenotipos Moser HW 1997, 2001 Patrones de Lesión anatómica Loes 2003 Clasificación de RMN en 5 grupos Severidad de Afectación Loes 1994 Escala de severidad de RMNespecífica para ALD-X de puntos Cerebral Infantil Cerebral Juvenil Adrenomieloneuropatía Cerebral Adulto Addison Aislado Asintomático Portadoras Sintomáticas Parieto-Occipital Frontal Cortico-Espinal Cerebelar Parieto-Occipital y Frontal

Definición o aproximación diagnóstica por determinación de AGCML BN (9 a/M) BML (4 a/F) BN (14 a/F) BE (11 a/M) 0,94 1,54 0,80 ND 0,09 12,91 15,48 13,34 0,68ND 10,43 BI (4 a/M) 1,44 0,0623,92 BM (2 a/M)1,61 0,0521,79 VG (madre) 1,25 0,0226,90 0,78 ND 0,74 0,92 0,51 ND Valores de Referencia ALD-X Hemicigota Normal ALD-X Heterocigota C24:0 (µg/ml) 0,84 ± 0,08 C24/C22 1,49 ± 0,45 1,09 ± 0,34 C26/C22 0,01 ± 0,01 0,07 ± 0,04 0,03 ± 0,02 13,34 ± 3,78 25,12 ± 4,83 25,43 ± 6,04 C26:0 (µg/ml) 0,22 ± 0,08 1,18 ± 0,53 0,70 ± 0,40 Pacientes Heterocigota ADL-X Hemicigota -CI Hemicigota- Asintomático No Afectado Heterocigota ND Hemicigota- Asintomático No Afectado CI BMT Asnt AA Asnt IBMB EB Metabolitos Primarios: ALD-X AGCML y AGCR en plasma Pacientes sospechados de EGP Heterocigotas ALD-X n=3 AGCML normal n=70 Hemicigotos ALD-XHeterocigotas ALD-X n=13 n=19 Sanos n=11 Familiares directos de ALD-X Hemicigotos ALD-X n=46

EB IBMB RMN Cerebral Normal EB RMN Score: 0 RMN patrón : Normal CI TMO Asnt AA Asnt 677CT Extensive involvement of periventricular white matter with temporal extension. Involvement of the splenium and body Corpus callosum, internal capsule, peduncles and protuberance parieto-occipital RMN patrón: 1 RMN Score: 4 IBMB EB 11y 10y7y INTEGRACIÓN DE METABOLITOS PRIMARIOS Y BIOMARCADORES SECUNDARIOS, A LA COMPATIBILIDAD CLÍNICA Familia EB

Marked slimness of the spinal cord. Diffuse atrophy RMN Cerebral : Normal OR 41 RMN patrón: 3 MRI Score: CI 9 10 CI AMN ? Asnt ? ? ? CI Asnt ? ? ? ? ?? ? 677 CC OR Sint 677 CT 677 CC INTEGRACIÓN DE METABOLITOS PRIMARIOS Y BIOMARCADORES SECUNDARIOS, A LA COMPATIBILIDAD CLÍNICA OR Familia OR Tracto corticospinal

Biomarcadores MolecularesVariación Fenotípica inter/intrafamiliar CBS InsIns CBS WIns CBS WW Controles n=95 X-ALD Hemicigotos n=9 CI AA AMN Asnt SintAsnt MTHFR 677TT MTHFR 677CT MTHFR 677CC Polimorfismos Estudiados X-ALD Heterocigotas n=11 Biomarcadores secundarios en EGP, específicamente en ALD-X

Caracterización del perfil de Ácidos Orgánicos Urinarios ≥ 300 metabolitos en corrida cromatográfica 1) lactato, 2) oxalato, 3) piruvato, 4) adipato, 5) p-OH- fenilacetato, 6) 2-cetoglutarato, 7) sebàcico, 8) p-OH- fenillactato, 9)estándar interno, 10) 3-OH sebàcico, 11) 3-6 epoxitetradecanedioico PERFIL AOU NORMAL Tiempo (min) 1) lactato, 2) oxalato, 3) cresol, 4) piruvato, 5) 3-OH-butirato, 6) gliceraldehído I, 7) 3-OH-isovalerato, 8) gliceraldehído II + urea, 9) fosfato + etilmalonato, 10) succinato, 11) adipato, 12) piroglutamato, 13) m-OH-fenilacetato, 14) p-OH-fenilacetato, 15) 2-cetoglutarato, 16) aconitato, 17) hipurato, 18)citrato, 19) estándar interno, 20) palmitato, 21) oleato, 22) estearato, 23 24) p-OH-hipurato PERFIL AOU Adrenoleucodistrofia Neonatal Hipotonía, dismorfias faciales, retraso psicomotor, convulsiones, cliteromegalia y disfunción hepática

Efectuar el diagnóstico o aproximación diagnóstica de EGP en nuestro medio. Brindar una posta asistencial no disponible con anterioridad y evitar una larga deambulación diagnóstica de la afección en cuestión. Definir en alta proporción el estado de portadora de ALD-X, entidad de aparente alta prevalencia en nuestra población. Precisar el asesoramiento genético en las familias involucradas, acorde a los conocimientos científicos actuales. Brindar el adecuado manejo del paciente, según su específica EGP. Estimaci ó n preliminar de avance del proyecto El estado de avance de la aplicación del Protocolo Clínico-Bioquímico posibilitó:

CEMECO

Metabolismo H 2 O 2 CatalasaAcatalasemia  Acido Pipecólico Degradación de Acido Pipecólico ? No identificada Hiperpipecolico Acidemia(variab) Metabolismo Glutaril- CoA Glutaril-CoA Oxidasa Glutarico Aciduria III  Acido Oxállico, Glioxílico Detoxificación Glioxilato Alaninaglioxilato Aminotransferasa Hiperoxaluria I  AGCR  -Oxidación de Acidos Grasos Fitanoil-CoA hidroxilasaER Alkil-DHAP Sintasa  Plasmalógenos Biosíntesis de Etherfosfolípidos DHAPAT CDRP RacemasaNeuropatía tardía Tiolasa IP-SZ D-Proteína BifuncionalP-SZ/ALDN Acil-CoA OxidasaP-ALDN  AGCML  - Oxidación de Acidos Grasos PALDX-ALD Fenotipo Bioquímico Función Metabólica Alterada Enzima/Proteína AfectadaFenotipo Clínico Deficiencias de una Unica Proteína Peroxisomal (DUP)

A. Defectos de la Biogénesis Peroxisomal (DBP) Sindrome de Zellweger (SZ) B. Deficiencias Enzimáticas Aisladas Condrodisplasia Rizomelica Punctata (RCDP) tipo I Enfermedad de Refsum Infantil (ERI) Adrenoleucodistrofia Neonatal (ALDN) β-Oxidación de Ácidos Grasos Adrenoleucodistrofia Ligada al Cromosoma X (ALD-X) Deficiencia de Acyl-CoA Oxidasa (ACOX1) Deficiencia Proteina D-Bifunctional (PDB) Deficiencia Proteina Transportadora de Sterol-X (SCPx) Deficienciencia 2-Methylacyl-CoA Racemasa (AMACR) Biosintesis Eterfosfolipidos Deficiencia Dihidroxiacetona fosfato aciltransferasa (DHAPAT) (CDRP Tipo II) Deficiencia Alquil-DHAP sintasa (CDRP Tipo III) α-Oxidacion de acidos grasos Enfermedad de Refsum (Deficiencia de Fitanoil-CoA hidroxilasa) Metabolismo del Peróxido de Hidrógeno Acatalasaemia (Deficiencia de Catalasa) Detoxificación del Glioxilato Hyperoxaluria Tipo I (Deficiencia de Alanina Glioxilato Aminotransferasa) C. Sindrome de Gen Contiguo Sindrome de Deleción Contigua ABCD1 DXS1357E (CADDS) PEX 7 Genes Involucrados GNPAT AGPS ABCD1 ACOX1 HSD17B4 AMACR SCP2 PHYH/PAHX AGXT CAT PEX 26, PEX 10, PEX 6, PEX 16, PEX 1, PEX 2, PEX 13, PEX 19, PEX 5, PEX 12 PEX 26, PEX 10, PEX 6, PEX 1, PEX 3, PEX 13, PEX 5, PEX 12 PEX 26,PEX 10, PEX 6, PEX 1, PEX 5, PEX 12 Genes Involucrados