Vibrio parahaemolyticus en Chile. Dr. Juan Carlos Hormazábal O. Jefe Subdepartamento Microbiología Clínica Instituto de Salud Pública de Chile.

Vibrio parahaemolyticus Aislado por primera vez en Japón en 1950. Uno de los agentes asociados a ETA más prevalentes en Asia. Causa de brotes desde 1969 en U.S.A. Asociado al consumo de alimentos de origen marino (bivalvos, crustáceos)

Vibrio parahaemolyticus. Características generales. Familia Vibrionaceae Bacilo, gram neg., móvil, no esporogénico Halófilo Parte de la flora normal de estuarios y costas del mundo. Densidad bacteriana ambiental aumenta en períodos cálidos. Capacidad de producir enfermedad variable, cepas ambientales mayoritariamente no patogénicas.

V. parahaemolyticus. Gastroenteritis: Dosis infectante: > 106 células Modo de transmisión: Ingestión de alimentos marinos crudos o mal cocinados. Contaminación cruzada ( con otros Alimentos o agua marina contaminados) Período a temperatura ambiental necesario. Reservorio: Costa marina, sedimento ( invierno), en agua libre (verano) Supervivencia: Crustáceos hasta 120 días.

Manifestaciones Clínicas. Gastroenteritis Infección Heridas Septicemia Infección Entérica: % Diarrea acuosa 98 Cólico abdominal 82 Náuseas 71 Vómitos 52 Cefalea 42 Fiebre 27 Calofríos 24 Período incubación 12-24 Hrs. (4-96 hrs). Proceso autolimitado ( 3 días ).

Fuente: SEREMI X Región (n = 502 acumulados al día 12 de febrero 2005)   Brote de Gastroenteritis por V. parahaemolyticus Principales Síntomas y Signos. Chile, Enero - Febrero 2005 Síntomas y Signos Porcentaje de frecuencia Dolor abdominal 90% Nauseas y vómitos 89% Diarrea sin sangre 80% Fiebre 77% Deshidratación 38% Parestesias 16% Calambres Diarrea con sangre 6% Cefalea 4%   Elaborado por Departamento de Epidemiología, Ministerio de Salud de Chile Fuente: SEREMI X Región (n = 502 acumulados al día 12 de febrero 2005)

Vibrio parahaemolyticus. Hallazgos de Laboratorio. Deposiciones acuosas, a veces mucoides o con sangre (<15%) Leucocitos fecales (+) TCBS agar, Colonias verde opacas. Pruebas Moleculares: - PCR Tdh-Trh (Lee et al., Bej A. Et al., Suthienkul et al.) - Hibridización sondas Tdh-Trh (Osawa et al., Nishibuchi M. Et al.) - Oligonucleotide array tech. (Bang-Xing Hong et al.) ELISA TDH-TRH

V. parahaemolyticus - + Flujograma Diag. Microbiológico. Deposición directa o en medio Cary Blair V. parahaemolyticus Flujograma Diag. Microbiológico. Agar TCBS Incubar 18-24 h a 35ºC Repicar colonias verdes a placa de Agar Sangre Incubar 4-5 h a 35ºC - OXIDASA + Descartar Siembra de TSI LIA MIO Incubar 18-24 h a 35ºC Oxidasa TSI LIA MIO Arginina Voges Proskauer Arabinosa Manitol Caldo Corazón (Indol) NaCi 0% NaCi 1% Diagnóstico Presuntivo Laboratorio de Referencia ISP Confirmación bioquímica No Si Confirmación Informe al Laboratorio Informe al Servicio de Salud Notificación al Ministerio de Salud Informe al Laboratorio

V. parahaemolyticus. Tratamiento No requerido en la mayoría de los casos. Tratamiento antibiótico no recomendado ya que no reduce el curso clínico ni la excreción del agente. Pacientes de edades extremas pueden requerir terapia de rehidratación oral o parenteral.

Vibrio parahaemolyticus. Fenómeno kanagawa Cepas patogénicas -hemólisis en Agar Wagatsuma. 95% aislamientos clínicos FK (+) (Joseph et al 1983, Morris 1985) 0.18-1% Aislamientos amb. son FK(+) En el ambiente un pequeño grupo de cepas patogénicas sobreviven en una extensa población de cepas no patogénicas. (Thomsom et al 1976, Joseph et al, 1983). FK asociado a Hemolisina Termoestable Directa (TDH)

TDH (hemolisina Termoestable Directa). V. parahaemolyticus, Factores de virulencia: TDH (hemolisina Termoestable Directa). Importante determinante de virulencia 90% cepas clínicas (Nishibushi et al., Miyamoto et al., Okuda et al., Wong et al.). <1% cepas ambientales. No inactivada por calor (100ºC por 10 min) Actividad hemolítica, citotóxica, aum. permeab. vasc.(Honda, Ljungh, Takeda et al). Aumenta flujo iónico en celulas intestinales (Cl), formación de porinas Fenómeno Kanagawa: Hemólisis en Agar Wagatsuma (Miyamoto et al., 1969). Cepas K(-) poseen gen tdh 16% (Nishibuchi et al.) Cepas k intermedias 1 copia tdh Cepas K(+) 2 copias tdh (1,2). Regulación expresión tdh: Fortaleza promotor VptoxRS operon: regulador global genes Vp. Expresión preferencial tdh2 (90%).

V. parahaemolyticus Factores de virulencia: TRH (Hemolisina Relacionada a TDH). Descubierta en brote islas Maldivas, aislamientos con con ausencia de tdh (Honda et al. 1987). Similares características biológicas, inmunológicas y fisicoquímicas a TDH Codificada por gen trh, 69% similaridad con tdh2 Puede coexistir con tdh (Okuda et al.) Generalmente asociado a producción de Ureasa (Okuda et al.) isla de patogenicidad (Park et al.)

Tipificación Vibrio parahaemolyticus. Serotipificación: Estandarizada, técnicamente dificultosa y cara (Centros de Referencia). O lipopolisacárido, K cápsula. O Group K Type 1 1,25,26,32,38,41,56,58,64,69 2 3,28 3 4,5,6,7,27,30,31,33,37,43,45,48,54,57,58,59,65 4 4,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63,67 5 5,15,17,30,47,60,61,68 6 6,18,46 7 7,19 8 8,20,21,22,39,70 9 9,23,44 10 19,24,52,66,71 11 36,40,50,51,61 12 52 Total 12 Total 65 El esquema antigenico fue propuesto por Sakazaki et al. 1963, Hugh, R., and J. C. Feeley. 1972, (Elliot. E. L., FDA U.S.A., 1998.)

O3:K6 O1:K56 O3:K6 O3:K6 O4:K12 O3:K6 O3:K6 O4:K68 O3:K6 O3:K6 O4:K63 O1:KUT O3:K6

Vibrio parahaemolyticus en Chile. Antecedentes: S.S. Arica desde inicio de años 90 envía cepas de casos clínicos para su confirmación por Lab. de Referencia. S.S. Antofagasta, Brote asociado a consumo de mariscos, 298 casos, Noviembre 1997-Abril 1998. S.S. Llanchipal, extenso brote Enero-Febrero 2004.

Brote de Intoxicación Alimentaria por Vibrio parahemolyticus en el Servicio de Salud Llanchipal. El domingo 18 de enero del 2004, se advirtió un importante aumento del número de consultas por cuadros de diarrea, cólicos, náuseas y vómitos. mayoritariamente en adultos y de evolución autolimitada (1-2 días). El total de casos superó los 1.500 y generó brotes en otras regiones del país.   Se realizó la investigación de brote y en todos los casos encuestados apareció el antecedente de consumo de mariscos. El 22 de enero, se estableció asociación con la extracción y consumo de mariscos en las playas del Seno de Reloncaví, comuna de Puerto Montt. Dra. Andrea Olea, Depto. Epidemiología MINSAL

Resultado confirmado por ISP: Vibrio parahemolyticus. S.S. Llanchipal: estudio de laboratorio de las muestras clínicas y ambientales. En áreas muestreadas, se observó un aumento de las temperaturas del agua de mar, de media estacional (verano) de 14°C a 19 - 20°C. Resultado confirmado por ISP: Vibrio parahemolyticus. El 22 de Enero MINSAL dicta Resolución que prohibe actividades extractivas y de comercialización de mariscos procedentes de las zonas afectadas. Posterior a esto, se observa una disminución de las consultas por esta causa en los Centros Asistenciales.   Dra. Andrea Olea, Depto. Epidemiología MINSAL

V. parahaemolyticus, cepas de erigen clínico recibidas por el Lab V. parahaemolyticus, cepas de erigen clínico recibidas por el Lab. de Referencia, ISP 1998- Marzo 2005. Sección Bacteriología, ISP-Chile

V. parahaemolyticus TDH-TRH 382 bp PCR TRH 460 bp Gen Secuencia Amplicon Referencia Tdh 5´atgttgaagctgtaccttga 3´ 5´gtaccgatattttgcaaa 3´ 382 bp Suthienkul et al. JID, 1995;172:1405-8 Trh 5´ctctactttgctgtacttga 3´ 5´aatattctggagtttcat 3´ 460 bp

Restricción enzima sfiI 04-73 Coprpocultivo 04-94 Coprocultivo 04-06 Coprocultivo 04-07 Coprocultivo 04-08 Coprocultivo 04-14-1 Ostras 04-95 coprocultivo 04-143 coprocultivo 04-145 coprocultivo 04-149 coprocultivo 04-157 Coprocultivo 04-171 coprocultivo 04-190 coprocultivo 04-200 coprocultivo 04-215 coprocultivo 04-268 coprocultivo 04-274 coprocultivo 04-276 coprocultivo 04-287 coprocultivo 04-316 Choritos 04-327 Coprocultivo 04-328 Coprocultivo 04-270 coprocultivo 04-39 Mariscos 04-42 Mariscos 04-152 Chorito 04-102 Choritos 04-15-1 Choritos 04-64 Choritos 04-88 Choritos 100 90 80 70 60 50 40 04-22 Cholgas 04-31 Cholgas 04-85 Choritos 04-86 Choritos 04-87 Choritos 04-90 Almejas 04-91 choritos 04-360 Agua Mar 04-12-1 Choritos 04-124 Cholgas 04-135 Choro Malton 04-92 coprocultivo 04-343 Coprocultivo 04-163 coprocultivo 04-32 Cholgas 04-105 Choritos 04-305 Cholgas 04-62 Choritos 04-363 Torula 04-62 Cholgas 04-154 Choritos 04-13-1 Navejuelas 04-33 Cholgas 04-99 Choritos 04-10 Choritos 04-107 Choritos 04-116 Choritos 04-30 Choritos 04-45 Mariscos 04-127 Choro Malton 04-351 Coprocultivo 04-125 Choro Malton 04-126 Choro Malton 04-128 Choro Malton 04-02 Ostras 04-139 Choro Malton 04-133 Choro 04-265 coprocultivo 04-17 Coprocultivo 04-19 Coprocultivo 04-21 Coprocultivo 04-58 Coprocultivo V. parahaemolyticus PFGE, patrones de Restricción enzima sfiI

V. parahaemolyticus Genotipos Orgen Clin/Amb Área TDH TRH 40 50 60 70 80 90 100 Orgen Clin/Amb Área TDH TRH 04-22 Cholgas Llanchipal (-) (-) 04-31 Cholgas Llanchipal 04-85 Choritos Llanchipal (-) (-) 04-86 Choritos Llanchipal (-) (-) 04-87 Choritos Llanchipal (-) (-) 04-90 Almejas Llanchipal (-) (-) 04-91 choritos Llanchipal (-) (-) V. parahaemolyticus 04-360 Agua Mar Llanchipal 04-12-1 Choritos Llanchipal (-) (-) 04-124 Cholgas Llanchipal (-) (-) 04-135 Choro Malton Araucania S (-) (-) (+) (+) (+) (-) 04-92 coprocultivo Osorno 04-343 Coprocultivo Val-S-Antonio 04-163 coprocultivo Val-S-Antonio 04-32 Cholgas Llanchipal (-) (-) 04-105 Choritos Llanchipal (-) (-) 04-305 Cholgas Llanchipal (-) (-) 04-62 Choritos Llanchipal (-) (-) 04-363 Torula Llanchipal 04-62 Cholgas Llanchipal (-) (-) Genotipos 04-154 Choritos Llanchipal (-) (-) 04-13-1 Navejuelas Llanchipal (-) (-) 04-33 Cholgas Llanchipal (-) (-) 04-99 Choritos Llanchipal (-) (-) 04-10 Choritos Llanchipal (-) (-) 04-107 Choritos Llanchipal (-) (-) 04-116 Choritos Llanchipal (-) (-) 04-30 Choritos Llanchipal (-) (-) (-) (-) 04-45 Mariscos M. Central 04-127 Choro Malton Araucania S (-) (-) 04-351 Coprocultivo Antofagasta (+) (-) 04-125 Choro Malton Araucania S (-) (-) 04-126 Choro Malton Araucania S (-) (-) 04-128 Choro Malton Araucania S (-) (-) 04-02 Ostras Llanchipal 04-139 Choro Malton Araucania S (-) (-) 04-133 Choro Araucania S (-) (-) (+) (+) (+) (-) 04-265 coprocultivo Arica 04-17 Coprocultivo Llanchipal 04-19 Coprocultivo Llanchipal 04-21 Coprocultivo Val-S-Antonio (+) (-) 04-58 Coprocultivo Araucania S 04-73 Coprpocultivo Llanchipal 04-94 Coprocultivo Maule 04-06 Coprocultivo Llanchipal 04-07 Coprocultivo Llanchipal 04-08 Coprocultivo Iquique 04-14-1 Ostras Llanchipal 04-95 coprocultivo Llanchipal 04-143 coprocultivo Valdivia 04-145 coprocultivo M. Oriente 04-149 coprocultivo Talcahuano 04-157 Coprocultivo Viña-Valpo 04-171 coprocultivo Concepción 04-190 coprocultivo Coquimbo 04-200 coprocultivo Araucania S 04-215 coprocultivo Maule (+) (-) 04-268 coprocultivo Arica 04-274 coprocultivo Arica 04-276 coprocultivo Arica 04-287 coprocultivo Coquimbo 04-316 Choritos Llanchipal 04-327 Coprocultivo Talcahuano 04-328 Coprocultivo Araucania S 04-270 coprocultivo Arica 04-39 Mariscos M. Central (-) (-) 04-42 Mariscos M. Central 04-152 Chorito Llanchipal 04-102 Choritos Llanchipal 04-15-1 Choritos Llanchipal 04-64 Choritos Llanchipal 04-88 Choritos Llanchipal

V. parahaemolyticus, Biotipificación.

Vibrio parahaemolyticus, serotipos mas frecuentes en cepas de origen clínico, ISP 1998-2004 2004 n=49

Vibrio parahaemolyticus, cepas de origen ambiental, no pandémicas, Chile 1998-2004

Genotipificación Vibrio parahaemolyticus, ISP 1998-2004 Año Origen Nº Cepas positivas   toxR tdh trh GS-PCR ORF8 PCR 2004 Clinico Ambiental 49 43 1 4 44 2003 36 34 7 29 2002 58 57 6 50 2001 14 3 10 2000 19 2 17 1999 1998 85 9 74 73

V. Parahaemolyticus Chile 1998-2004 Determinacion de grupos pandémicos   

Vibrio parahaemolyticus, serotipos pandemicos y no pandemicos en cepas Ambientales, ISP 1998- 2004   Source Serotype Year of isolation 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 Total Pandemic Environmental O3:K6 NA 1 Non pandemic O3:KUT O4:K9 O4:KUT O5:K30 O6:KUT O10:KUT O11:KUT Total 15 9 4 2   42  

Interpretación Susceptibilidad V. parahaemolyticus   Susceptibilidad V. parahaemolyticus ISP total 99 cepas, año 2005 Antimicrobiano Interpretación   Resistente Intermedio Sensible Ampicilina* 61 (61,6%) 38(38,4%) Tetraciclina* 1(1%) 98(99%) Gentamicina** 61(61,6%) 37(37,4%) Ciprofloxacino** 7(7,1%) 92(92,9%) SXT* 97(99%) A. Nalidíxico** 2(2%) 97(98%) Cloranfenicol* 97(100%) Ceftriaxona** 99(100%) *Lectura tabla NCCLS de Vibrio cholerae **Lectura tabla NCCLS Enterobacterias

V. parahaemolyticus en Chile. Patógeno emergente. Estabilidad Clon pandémico O3:K6 Cepas no pandémicas Inmunidad natural Inóculo Pautas de manejo clínico Control ambiental

Agradecimientos: Sección Bacteriología ISP T.M. Wally Silva T.M. Berta Olivares T.M. Soledad Prat Tec Lab. Ana Mella Tec. Lab. Esperanza Ugarte Unidad de Desarrollo ISP PhD. Jorge Fernández Centre for Diarrhoeal Disease Research, Dhaka, Bangladesh Dr. Balakrish Nair