Las fases móviles pueden ser líquidos o gases y fluidos supercriticos CROMATOGRAFÍA La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla. Debe existir una fase estacionaria y una fase móvil, la muestra se distribuye en ambas fases y sus componentes son retenidos selectivamente por la fase estacionaria La fase estacionaria puede ser un sólido poroso, un líquido en un soporte sólido Las fases móviles pueden ser líquidos o gases y fluidos supercriticos
CLASIFICACIÓN Según la fase móvil : Líquida Gas, Fluidos supercríticos Según la técnica: Papel Capa fina Columna Según la muestra : Preparativa y Analítica
Cromatograma
DEFINICIONES Tiempo de retención (tr). Tiempo muerto (tm) Tiempo de retención corregido (tr) Factor de capacidad o retención móvil, es adimensional y se define como: K Factor o Coeficiente de distribución o Reparto (K). Es K = Kx Siendo la relación de fases, = ml de la fase móvil / ml de la fase estacionaria Número de platos teóricos N = 16(tr/w)2 Altura equivalente de plato teórico AEPT= L/N
Cromatografía en papel
Cromatografía capa fina
CROMATOGRAFIA LIQUIDA ALTA RESOLUCIÓN HPLC
FASE MOVIL Disponible comercialmente Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad de pureza cromatográfica Disolver la muestra No degradar la fase estacionaria y No reaccionar con ella Miscible con otros solventes para formar mezclas útiles Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión Ser compatible con el detector utilizado.
FASES MÓVILES Fase Acetonitrile 41 82 1.341 195 .358 3.37 Dioxane 88 MW BP[°C] R.I. [nm] UV [nm] Viscos. [cP] µ[Debye] Acetonitrile 41 82 1.341 195 .358 3.37 Dioxane 88 101 1.421 215 1.26 0.45 Ethanol 46 78 1.359 205 1.19 1.68 Methanol 32 65 1.326 .584 1.66 Isopropanol 60 1.375 2.39 Tetrahydrofuran 72 66 1.404 2.20 1.70 Water 18 100 1.333 185 1.00 1.84
Métodos de Filtración de Solventes en HPLC Filtro a la Entrada del Solvente Filtración al Vacío Filtración en Línea
Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLC Sonificación Burbujear Helio Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo
Válvula de Inyección
Loop de inyección en dos posiciones
SISTEMA DE INYECCION Este sistema debe cumplir: Introducir volúmenes pequeños y reproducibles de muestra. Originar la menor dispersión física posible a fin de evitar ensanchamiento de picos. No debe interrumpir el flujo, y no debe variar momentáneamente la presión y el caudal.
SISTEMAS DE BOMBEO Debe producir presiones estables hasta 6000 psi. Mantener el flujo libre de pulsaciones Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min) Control y reproducibilidad del flujo de solvente Componentes de la bomba resistentes a la corrosión
Sistemas de Bombeo Mecánico: Neumático. Reciprocantes (Pistón) generan altas presiones 500 a 5000 psi . Desplazamiento continuo Neumático.
EMPAQUES Sólido: Sílica Polímero Amorfo Polímero cargado Azúcares Líquido enlazado: Resina Glicól. Quimicamente enlazada: Grupos Silanoles C8, C18, CN, NH.
FORMA DEL EMPAQUE. Micropartículas Esféricas menores de 10 micras Macropartículas Esféricas mayores de 10 micras Películas de Esferas recubiertas de micropartículas
SISTEMA DE DETECCIÓN Todas las técnicas instrumentales que sean compatibles con el sistema cromatográfico, las más utilizadas son: UV-VIS Indice de refracción Conductimetria IR RMN Fluorescencia
Sistema de Registro Generalmente proporcionan una carta en función de la señal vs tiempo de elución. Además reportan tr área del pico, % del área A total. Parámetros a fijar en la carta Velocidad de la carta Atenuación Supresión Punto inicial de inyección Marcas de pico.
Fenómenos Adsorción Reparto Intercambio iónico Filtración por tamaños moleculares
Cromatografía Líquida Partición normal FM es menos polar que FE Partición en fase reversa FM es más polar que FE Adsorción. Competencia de las moléculas de la muestra y de la fase móvil por los sitios activos del sólido. La actividad superficial del sólido se ve afectada por la retención de ciertas moléculas de alta polaridad. Intercambio iónico Aniónica Catiónica Cromatografía liq. de exclusión por tamaños. Cromatografía de permeación o filtración según tamaños de las moléculas
Buena Resolución R cerca de 1,5 Mínimo cambio de Presión Optimizar Buena Resolución R cerca de 1,5 Mínimo cambio de Presión Tiempo de Análisis Corto Alta eficiencia
Orden para optimizar Cambio de polaridad de la fase móvil Cambio de flujo Cambios de pH, salinidad, T, viscosidad Cambiar columna
Efecto tipo de columna