SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS

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1 SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 TEMA 16 INTRODUCCIÓN A LAS SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS Sin duda alguna, el modo más comúnmente utilizado para realizar separaciones analíticas es la cromatografía, un método que presenta aplicaciones en todas las ramas de la ciencia.

2 CONTENIDOS Fundamentos Clasificación El proceso cromatográfico
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 CONTENIDOS Fundamentos Clasificación El proceso cromatográfico Parámetros fundamentales Aplicaciones de la cromatografía

3 Tswett (1872-1919) Chroma: color Graphein: escribir CROMATOGRAFÍA Fase
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 1. Fundamentos 1903: usó columnas de adsorción para separar pigmentos vegetales Fase móvil Pigmentos vegetales Fig.1 Tswett ( ) Fase estacionaria Chroma: color Graphein: escribir 1. FUNDAMENTOS La cromatografía agrupa a un conjunto importante y diverso de métodos, que permite a los científicos separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros medios. La cromatografía en columna fue inventada a principios del siglo XX por el botánico ruso Mijaíl Tswett, quien empleó la técnica para separar pigmentos vegetales, pasando disoluciones de estos compuestos a través de una columna de vidrio rellena con un material sólido finamente dividido. Las especies ya separadas aparecían como bandas coloreadas en la columna, justificando así el nombre que este científico eligió para el método: «chroma» (color) y «graphein» (escribir). En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se disuelve en una fase móvil (que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico). Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible, la cual se mantiene fija en una columna o sobre una superficie sólida. Las dos fases se eligen de modo que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son retenidos con fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. CROMATOGRAFÍA

4 2A. Según la disposición de la fase estacionaria:
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Clasificación 2A. Según la disposición de la fase estacionaria: Cromatografía plana: Cromatografía en capa fina Cromatografía en papel Cromatografía en columna Cromatografía de líquidos Cromatografía de gases Cromatografía de fluidos supercríticos 2. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Los métodos cromatográficos pueden clasificarse de acuerdo a dos criterios diferentes: La primera clasificación atiende a la forma en la que la fase estacionaria se encuentre dispuesta. Nos referimos a cromatografía plana cuando la fase estacionaria se mantiene sobre una placa lisa o en los intersticios de un papel y la fase móvil se desplaza a través de la estacionaria por gravedad o por capilaridad. Por otro lado, cuando la fase estacionaria se halla dispuesta en el interior de una columna, hablamos de cromatografía en columna, distinguiendo entre cromatografía de líquidos, de gases o de fluidos supercríticos, si la fase móvil es un gas, un líquido o un fluido supercrítico, respectivamente.

5 Cromatografía en papel
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Clasificación CROMATOGRAFÍA PLANA Papel Cromatografía en papel Fase estacionaria Adsorbente sobre soporte Cromatografía en capa fina Gel de sílice, poliamida…. Lámina de vidrio, de plástico o metálica Tapadera METODOLOGÍA DE TRABAJO En cromatografía plana, la fase móvil es siempre un líquido, mientras que la fase estacionaria puede ser también un líquido (agua empapada en la celulosa de una superficie de papel) en cuyo caso tenemos la «cromatografía en papel» o un sólido adsorbente (gel de sílice, poliamida…) colocado sobre un soporte (lámina de vidrio, de plástico o de metal), lo que se conoce como «cromatografía en capa fina». La diapositiva muestra un esquema de la metodología de trabajo en cromatografía plana, concretamente para el caso de cromatografía en papel, donde la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad. Etapa 1: En principio se colocan unas gotas de la mezcla a separa sobre la fase estacionaria, (etapa 2) que es seguidamente colocada en un recipiente que contiene la fase móvil, (etapas 3 y 4) al elevarse ésta última por la fase estacionaria va arrastrando la mezcla de modo que los componentes se irán separando de acuerdo a su movilidad. Etapa 5: Finalmente se saca la fase estacionaria del tanque de fase móvil y se deja secar. La Figura 1 es un dibujo tridimensional donde vemos el tanque de fase móvil y la disposición de la fase estacionaria dentro del mismo. Papel Frente de fase móvil 5 Fase móvil 1 Fig.1 2 3 4

6 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Clasificación CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Muestra (A+B) Fase móvil B Fase estacionaria B A B En cromatografía en columna, como su nombre indica, la fase estacionaria se encuentra dispuesta en el interior de una columna y la fase móvil puede ser un líquido, un gas o un fluido supercrítico. La diapositiva muestra de forma esquemática como tiene lugar el proceso de separación en este tipo de cromatografía: la fase móvil fluye de forma continua durante todo el proceso, y en dicho flujo es inyectada la muestra bajo análisis, de modo que la distinta movilidad de los componentes de la muestra provocará su separación. A B

7 2B. Según el tipo de fase móvil:
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Clasificación 2B. Según el tipo de fase móvil: Cromatografía de líquidos (LC) Cromatografía de gases (GC) Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) En columna o en superficie plana En columna La segunda clasificación de los métodos de separación se basa en el tipo de fase móvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los componentes de la muestra entre las fases. De este modo, las tres clases generales de cromatografía son: cromatografía de líquidos, cromatografía de líquidos y cromatografía de fluidos supercríticos; para las que las fases móviles son líquidos, gases y fluidos supercríticos, respectivamente. Es de destacar que solamente la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse a cabo bajo en columna y en superficie plana; por otro lado, la cromatografía de gases y la de fluidos supercríticos están restringidas a los procedimientos en columna. A continuación vamos a presentar una clasificación más detallada de los métodos cromatográficos en columna.

8 CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN COLUMNA
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Clasificación CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN COLUMNA Método Técnica Fase estacionaria Tipo de equilibrio LC Reparto Líquido adsorbido sobre un sólido Distribución entre líquidos inmiscibles Adsorción Sólido Intercambio iónico Resina de Intercambio Iónico Exclusión por tamaños Líquido en intersticios de un sólido polimérico Distribución/Exclusión GC Gas-líquido Distribución entre gas y líquido Gas-sólido SFC Especies orgánicas enlazadas a superficie sólida Distribución entre fluido supercrítico y superficie enlazada La tabla de la diapositiva resume los principales métodos cromatográficos en columna indicando para cada uno de ellos el tipo de fase móvil, de fase estacionaria y el equilibrio que tiene lugar para la separación de los solutos. Dentro de la cromatografía líquida (LC) citamos cuatro técnicas cromatográficas: En la LC de reparto, la fase estacionaria es un líquido adsorbido sobre un sólido, y la separación tiene lugar por distribución de los solutos entre líquidos inmiscibles. Una modalidad muy relacionada con ésta es la LC de reparto con fases enlazadas, para la que la fase estacionaria es una especie química de carácter orgánico que se halla enlazada químicamente a través de enlaces covalentes a la superficie de un sólido soporte. En este caso el equilibrio tiene lugar por distribución entre la fase móvil (líquida) y la especie orgánica enlazada. En la modalidad básica de LC de reparto, la fase estacionaria líquida se halla adsorbida físicamente sobre el sólido soporte. Nos referimos a LC de adsorción cuando la fase estacionaria es un sólido y el equilibrio es heterogéneo (líquido-sólido) de adsorción sobre dicho sólido. En la LC de intercambio iónico la fase estacionaria es un sólido, concretamente una resina de intercambio iónico, el equilibrio tiene lugar por intercambio de equivalentes de compuestos iónicos. La retención se basa en la atracción electrostática entre los iones de la muestra y las cargas inmovilizadas en la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. Por último dentro de la LC destacaremos la de exclusión por tamaños, en la que la fase estacionaria consiste en polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. De modo que los componentes de menor tamaño molecular podrán acceder a los poros de la fase estacionaria, siendo más retenidos que las especies de mayor tamaño molecular que viajarán a mayor velocidad y serán eluidos antes de la columna. Dentro de la cromatografía de gases (GC) citamos dos técnicas cromatográficas: En la cromatografía gas-líquido, la fase estacionaria es un líquido adsorbido sobre un sólido, alcanzándose el equilibrio por distribución de las especies a separar entre la fase móvil gaseosa y la fase estacionaria líquida. De igual modo que en LC de reparto, para la cromatografía gas-líquido existe una variante en la que la fase estacionaria es una especie de carácter orgánico, que se halla enlazada químicamente a una superficie sólida, el equilibrio también será de distribución entre las fases y hablamos de cromatografía gas-fase enlazada. En la cromatografía gas-sólido, la fase estacionaria es un sólido, y el equilibrio es de adsorción sobre dicha fase estacionaria. Cuando la fase móvil es un fluido supercrítico, como ya hemos mencionado, el método se denomina cromatografía de fluidos supercríticos (SFC), y solamente existe un tipo de técnica que lleva el mismo nombre que el método. La fase estacionaria es una especie de carácter orgánico enlazada a una superficie sólida, y el equilibrio tiene lugar entre la fase móvil y dicha superficie enlazada. Puesto que un fluido supercrítico no es ni un líquido ni un gas, pero en ciertos aspectos se comporta como un líquido y en otros como un gas, la SFC se encuentra a caballo entre la LC y la GC, considerándose a veces como una técnica complementaria a éstas.

9 ● B A B B A B ● ● ● ● ● ● A B 3. El proceso cromatográfico Muestra
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 3. El proceso cromatográfico Muestra (A+B) Fase móvil ● B Fase estacionaria A B B A B 3. EL PROCESO CROMATOGRÁFICO Durante el desarrollo de una separación cromatográfica, la fase móvil arrastra las moléculas de la muestra a través del lecho de la fase estacionaria. Durante el trayecto las distintas especies químicas que forman la muestra, son retardadas por la fase estacionaria en función de su interacción con las fases estacionaria y móvil. Estas interacciones son selectivas, lo cual significa que para un determinado sistema, serán diferentes para cada componente de la muestra. La Figura de la diapositiva muestra cómo se separan dos sustancias A y B en una columna cromatográfica con una fase móvil líquida. La elución implica el transporte de una especie a través de una columna por adición continuada de fase móvil. A tiempo cero se inyecta una porción de la muestra en la cabeza de la columna, tras lo que los componentes de la misma se distribuyen entre las dos fases. Las sucesivas adiciones de fase móvil hacen avanzar las moléculas de soluto por la columna en una serie de continuas transferencias entre la fase móvil y estacionaria; por ello se dice que se trata de una separación múltiple, donde el equilibrio entre la fase inicial y la segunda fase se alcanza un número muy elevado de veces. Sin embargo, debido a que el movimiento de los solutos sólo puede ocurrir en la fase móvil, la velocidad media a la que una zona de soluto migra por la columna depende de la fracción de tiempo que reside en esta fase. Esta fracción de tiempo es pequeña para sustancias que son retenidas fuertemente por la fase estacionaria (sería el caso de la sustancia B, en la figura) y es grande cuando es la sustancia es más afín a la fase móvil (sustancia A, de la figura). Obsérvese que al colocar a la salida de la columna un detector al que las especies A y B respondan, se obtiene el cromatograma correspondiente a la separación al representar la señal analítica en función del tiempo. La Figura de la diapositiva permite reconocer dos hechos característicos de la separación cromatográfica: la migración diferencial de los componentes de la muestra y un ensanchamiento de la banda de las moléculas de cada soluto a lo largo de la columna. La migración diferencial es la base de la separación en cromatografía, sin una diferencia en las velocidades de migración de los compuestos, la separación no tendría lugar. La migración diferencial está determinada principalmente por la composición de la fase móvil y de la fase estacionaria. Detector ● ● ● ● ● ● t t t t t t t6 A Señal analítica B Tiempo, min t t t t t t t6

10 ENSANCHAMIENTO DE BANDAS
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 3. El proceso cromatográfico ENSANCHAMIENTO DE BANDAS Columna Comienzo Fig.1 Perfil de concentración El ensanchamiento de la banda a lo largo de la columna se debe a procesos físicos. Debido a este fenómeno, mientras la concentración de soluto en la banda inicial es uniforme, posteriormente sigue, en el caso ideal, un perfil de distribución normal, cuya desviación estándar va aumentando a lo largo del recorrido en la columna cromatográfica. Por tanto, la anchura de una banda aumenta a medida que el compuesto va atravesando la columna, debido a que cuanto más tiempo transcurre mayor es la dispersión que puede tener lugar. Por ello, la anchura de la zona está directamente relacionada con el tiempo de residencia en la columna, e inversamente con la velocidad de flujo de la fase móvil. Fig.2 Tiempo

11 tr´ = tr - tm CH4 Octano Nonano 4. Parámetros fundamentales
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Parámetros fundamentales Respuesta del detector CH4 Octano No identificado Nonano Inyección 4. PARÁMETROS FUNDAMENTALES La figura muestra un cromatograma característico para una muestra que contiene cuatro analitos y haciendo uso del mismo presentaremos los parámetros fundamentales en cromatografía. El tiempo de retención de un soluto, tr ó tR, se define como el tiempo que transcurre desde el momento de la inyección de la muestra hasta la aparición de la máxima concentración del compuesto eluido en el detector. En la figura aparece representado tr para el compuesto no identificado. Cuando un compuesto no sufre ninguna interacción con la fase estacionaria, es eluido a un tiempo denominado tiempo muerto, tm o t0. En la figura el compuesto no retenido por la fase estacionaria es el metano. La diferencia entre el tiempo de retención y el tiempo muerto representa la interacción del soluto con la fase estacionaria y recibe el nombre de tiempo de retención corregido, tr´. Tiempo Fig.1 tr´ = tr - tm

12 Factor de retención (k)
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Parámetros fundamentales Factor de retención (k) k << 1: elución demasiado rápida k~ 20-30: elución demasiado lenta 2 < k < 10: elución ideal Factor de selectividad (α) α = 1: Los compuestos no están separados α > 1: Los máximos de los picos cromatográficos están separados El factor de retención (k), también llamado factor de capacidad, es un parámetro importante que con frecuencia se utiliza para describir las velocidades de migración de los analitos en las columnas. Representa la retención de un compuesto relativa a la elución de otro compuesto no retenido, por lo que se calcula como el cociente entre el tiempo de retención corregido del analito y el tiempo muerto. K también puede ser definido como el tiempo que pasa el soluto en la fase estacionaria dividido entre el tiempo que pasa en la fase móvil; lógicamente si el soluto pasa todo su tiempo en la fase móvil, será eluido al tiempo muerto. Cuando el factor de retención para un compuesto es mucho menor que la unidad, la elución tiene lugar en un periodo de tiempo tan corto que en la práctica es difícil determinar los tiempos de retención. Si el factor de retención es del orden de 20 a 30 veces o mayor, los tiempos de elución son entonces excesivamente largos, y como consecuencia se producirá un excesivo ensanchamiento de las bandas en la columna. De forma ideal, las separaciones se llevan a cabo en condiciones en las que los valores de k para las distintas especies a separar se hallen entre 2 y 10. El factor de selectividad o retención relativa, α, se expresa como la relación entre los factores de retención de los dos picos de interés, apareciendo en el numerador el factor de retención de la especie más fuertemente retenida y en el denominador el de la especie que eluye con más rapidez. Según esta definición, el factor de selectividad es siempre mayor o igual a la unidad. Una separación entre dos componentes A y B de una mezcla sólo será posible si α tiene un valor distinto de la unidad. El volumen de retención, Vr, es el volumen de fase móvil necesario para eluir a un soluto determinado de la columna, y se calcula como el producto del tiempo de retención del soluto por la velocidad de flujo de la fase móvil. Volumen de retención (Vr) ur : caudal de la fase móvil

13 wi wh wb wi = 2σ wb = 2wi wh = 2,35σ wb = 1,7wh wb = 4σ
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Parámetros fundamentales ANCHURAS CARACTERÍSTICAS Respuesta del detector Tiempo t = 0 Inyección Punto de inflexión tr wi wh wb Como ya se ha indicado anteriormente, el pico cromatográfico corresponde, de manera ideal, a una curva de distribución normal o gaussiana. Este tipo de curvas se caracterizan por su desviación estándar, σ. La anchura de pico en cualquier punto puede expresarse como múltiplo de la desviación estándar. Son tres las anchuras características de un pico cromatográfico: Anchura en los puntos de inflexión: La distancia que separa los puntos de inflexión en la curva es igual al doble de σ, y se representa como wi. Recordemos que los puntos de inflexión se localizan al 60,7% de la altura máxima. Anchura a la mitad de la altura: Como su nombre indica es la anchura del pico justo a la mitad de su altura máxima, y se representa como wh ó w1/2. Anchura en la base del pico: Se obtiene trazando las tangentes del pico en sus puntos de inflexión y midiendo la longitud de la línea base que queda comprendida entre los puntos donde cortan las tangentes. Fig.1 wi = 2σ wb = 2wi wh = 2,35σ wb = 1,7wh wb = 4σ

14 Eficacia de una columna: H, L
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Parámetros fundamentales Eficacia de una columna: H, L L H «Martin y Synge» wb = 4σ Para describir la eficacia de una columna para una determinada separación cromatográfica se utilizan con frecuencia dos parámetros: altura de plato, H, y número de platos teóricos, N. La teoría de platos fue desarrollada por los cromatografistas Martin y Synge, quienes recibieron el premio nobel en Esta teoría considera la columna como formada por capas contiguas o discos (a los que llamaban platos) de una determinada altura, alcanzándose el equilibrio entre la fase móvil y la estacionaria en cada uno de ellos. El movimiento del analito a través de la columna se trataba como una transferencia por etapas de la fase móvil equilibrada de un plato al siguiente. De esta forma, cuanto mayor sea el número de platos de la columna o lo que es lo mismo, cuanto menor sea la altura de los mismos, más veces se alcanzará el equilibrio durante la separación, y por tanto la columna será más eficaz en la separación de los componentes de la muestra. Los parámetros N y H se hallan relacionados, a través de la ecuación expuesta en la diapositiva, donde L es la longitud (normalmente en centímetros) del relleno de la columna. Las eficacias en términos de número de platos pueden variar desde unos pocos cientos hasta varios cientos de miles; y por consiguiente pueden obtenerse valores para las alturas de plato desde unas pocas décimas a una milésima de milímetro o incluso menos. Al asumir que las bandas cromatográficas tienen forma gaussiana, resulta muy conveniente definir la eficacia de una columna en los términos de varianza por unidad de longitud de la columna, de este modo la altura de plato es igual al cuadrado de la desviación estándar dividido por la longitud de la columna. Expresión que combinada con aquella que relaciona N y H a través de L, y la definición de la anchura de pico en la base, nos permite obtener una ecuación para el cálculo de N, en función de parámetros obtenidos directamente del cromatograma. En la diapositiva se muestra asimismo como se calcula el número de platos para la separación de n compuestos, como el sumatorio de los valores de N obtenidos para cada compuesto dividido por el número total de especies. «n compuestos en el cromatograma»:

15 Factor de resolución (Rs)
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Parámetros fundamentales Factor de resolución (Rs) Fig.1 El factor de separación, anteriormente explicado, expresa la posición relativa entre picos adyacentes, pero no proporciona información alguna sobre la separación real de los picos, que depende de la eficacia de la columna. Observemos los dos cromatogramas de la diapositiva obtenidos para la separación de las especies A y B empleando dos columnas diferentes. Si calculamos el factor de separación veremos que se obtiene el mismo valor en ambos casos. Sin embargo, a simple vista se percibe que las eficacias de las columnas son diferentes. La resolución de una columna, Rs, constituye una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos compuestos y se calcula como el cociente entre la distancia de los máximos de los dos picos adyacentes y el valor medio de las anchuras de los picos en la base. De forma general se considera que una resolución de 1,5 permite una separación completa de los dos compuestos, mientras que si Rs tiene un valor de 1 esto significa que la separación entre los picos es de un 90%, no llegando a caer totalmente el primer pico cromatográfico hasta la línea base cuando ya empieza a ser eluido el siguiente. Aunque siempre se prefieren valores de Rs iguales o superiores a 1,5; si Rs se halla entre 1 y 1,5 la separación aunque no ideal puede ser aceptable. Desde luego no son aceptables valores de Rs inferiores a 1. Para una fase estacionaria dada, la resolución puede mejorarse utilizando columna de mayor longitud, aumentando así el número de platos. Sin embargo, una consecuencia del aumento de N es el aumento del tiempo requerido para la separación. Rs ≥ 1,5: separación ideal 1,5 > Rs > 1: separación aceptable Rs < 1: separación inaceptable Rs= Δt wb,A + wb,B 2

16 4. Parámetros fundamentales
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Parámetros fundamentales Resolución = 0,5 Resolución = 0,75 Señal Señal Resolución = 1 Resolución = 1,5 La figura muestra como valores de resolución de 0,5 y 0,75 suponen un solapamientos considerable entre los picos, por lo que no se considera que la separación sea efectiva; sin embargo, el solapamiento observado para un factor de resolución igual a uno es muy pequeño y por tanto si no puede ser mejorado, resulta aceptable. Véase finalmente que no existe ningún solapamiento entre los picos si Rs es igual a 1,5. Señal Señal Tiempo Tiempo F1

17 concentraciones inferiores a los correspondientes límites de detección
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 5. Aplicaciones de la cromatografía Análisis cualitativo Señal analítica Tiempo CH4 Octano Nonano Decano Disolución estándar ¿Nonano? ¿Decano? Muestra F1 La muestra no contiene metano ni octano. Si los contiene será a concentraciones inferiores a los correspondientes límites de detección 5. APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA La cromatografía ha llegado a ser considerada como el principal método de separación de especies químicas estrechamente relacionadas entre sí. Puede emplearse tanto para análisis cualitativo (identificación de especies) como para análisis cuantitativo (cuantificación de las especies separadas). Análisis cualitativo. Un cromatograma proporciona solo una parte de la información cualitativa correspondiente a las especies de la muestra, concretamente su tiempo de retención. No obstante, la confirmación de la identidad requiere la investigación química o espectral de los componentes aislados. Es importante considerar que, aunque los cromatogramas no conducen a una identificación positiva de las especies presentes en una muestra, proporcionan a menudo la evidencia segura de la ausencia de ciertos compuestos. Así, si en la muestra no aparece un pico con el mismo tiempo de retención que el estándar en las mismas condiciones experimentales, se puede asumir que el compuesto en cuestión está ausente (o si se halla presente, será a una concentración por debajo del límite de detección del procedimiento). En la diapositiva observamos el cromatograma obtenido para una disolución estándar mezcla de cuatro analitos, si se inyecta la muestra en el sistema cromatográfico empleando idénticas condiciones experimentales que las usadas para la mezcla de estándares y no se obtienen picos a los tiempos de retención de metano y octano, podemos asegurar que la muestra no contiene dichos compuestos o si los contuviese sería a concentraciones inferiores a los correspondientes límites de detección del procedimiento aplicado. Ahora bien, habiendo obtenido para la muestra, picos cromatográficos a los mismos tiempos de retención de nonano y decano, será necesario chequear la identidad de los componentes eluidos. Los métodos empleados en este sentido se basan generalmente en la comparación de las características cromatográficas de los componentes con componentes de referencia o bien el uso de detectores en línea, considerándose el espectrómetro de masas el detector ideal para LC ya que proporciona información sobre estructuras y además permite detectar y cuantificar un gran número de compuestos. Identificación positiva: - Comparación de datos de retención - Uso de detectores en línea

18 MÉTODOS DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO CUANTITATIVO
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 5. Aplicaciones de la cromatografía Análisis cuantitativo Señal analítica Tiempo tr tm Altura, h Área Fig.1 MÉTODOS DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO CUANTITATIVO 1. Calibración con patrones La cromatografía cuantitativa en columna se basa en la comparación de la altura, o del área, del pico del analito con la de uno o más estándares. En cromatografía plana, el área cubierta por las especies separadas sirve como parámetro analítico. Si se controlan adecuadamente las condiciones experimentales, esos parámetros varían linealmente con la concentración. La altura de un pico cromatográfico, h, se obtiene extrapolando la línea base por debajo del pico y midiendo la distancia perpendicular desde esta línea hasta el máximo del pico. Es importante resaltar que las alturas de pico están inversamente relacionadas con las anchuras de pico. Por ello, con las alturas de pico se obtienen resultados exactos solo si las variaciones en las condiciones de la columna no alteran las anchuras de pico durante los cromatogramas de la muestra y de los estándares. Sin embargo, el área de pico es independiente de los efectos del ensanchamiento de los picos, por lo que resulta un parámetro analítico más adecuado que las alturas, con fines de cuantificación. Los instrumentos cromatográficos más modernos permiten una integración precisa del área de los picos; en caso de no disponerse de tales equipos, es necesario llevar a cabo una estimación manual del área. A continuación vamos a describir brevemente los métodos más empleados para el análisis cromatográfico cuantitativo: A. Calibración con patrones: El método más sencillo implica la preparación de una serie de disoluciones patrón de concentración conocida y del orden de la de la muestra. A continuación se obtienen los cromatogramas de los patrones y se representan las áreas o alturas de pico en función de la concentración. La representación gráfica de los datos debe originar una línea recta que pase por el origen de coordenadas. La sustitución del área o altura obtenida en la muestra en la ecuación de calibración correspondiente conduce a la obtención de la concentración de analito en la muestra. Preparación de disoluciones patrón Obtención de sus cromatogramas

19 Se añade a disoluciones
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 5. Aplicaciones de la cromatografía B. Método del estándar interno Se añade a disoluciones patrón y a muestras Analito 1 Estándar interno Señal analítica B. Método del estándar interno: Generalmente, en cromatografía cuantitativa el uso de patrones internos aporta mayor precisión al método ya que se evitan las incertidumbres asociadas a la inyección de la muestra. Este método consiste en introducir en cada disolución estándar así como en la muestra una cantidad exactamente medida de una sustancia estándar a la que se llama patrón interno. La relación entre las áreas (o alturas) del analito y del estándar interno es el parámetro analítico que representado frente a la concentración de analito origina una línea recta, cuya ecuación permite calcular la concentración de analito en la muestra. La aplicación de este método requiere que el pico del estándar interno se halle bien separado de los de los componentes de la muestra y además debe aparecer preferiblemente entre los compuestos bajo análisis, lo que significa que presenta un comportamiento cromatográfico parecido al del los analitos. Analito 2 Tiempo Fig.1

20 CRÉDITOS DE LAS ILUSTRACIONES – PICTURES COPYRIGHTS
Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 CRÉDITOS DE LAS ILUSTRACIONES – PICTURES COPYRIGHTS Logo encabezado de páginas OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia. Dirección web: Página 3, Fig.1. Dirección web: Página 5, Fig.1. Dirección web: Página 10, Fig.1 y Fig.2. Dirección web: Páginas 11, 13, 15 y 17, Fig.1. Dirección web: Página 18, Fig.1. Dirección web: Autor: CCC/CHT Original uploader was Sortjai at nl.wikipedia. Página 19, Fig.1. Dirección web: Autor: User Dubaj on sk.wikipedia