Interacciones entre el proceso inflamatorio y nutrición de hierro en sujetos obesos y/o diabéticos tipo 2 Mónica Andrews, Miguel Arredondo. Laboratorio de Micronutrientes. INTA. Universidad de Chile Financiamiento: Beca Ciencias Básicas SOCHED 2010 FONDECYT:

Factores Ambientales Factores No Modificables Factores Genéticos

pO 2 Hipoxia Inflamación Trayhurn et al, Br J Nutr. 92: Hintze KJ et al, Biol Trace Elemn Res.

INFLAMACIÓN HIPOXIA NF-kB TNF- ɑ IL-6 Aumento proteínas fase aguda Resistencia periférica a la insulina Disminución adiponectina Resistencia a la insulina hepática Redistribución del hierro corporal 1) Trayhurn et al, Br J Nutr. 92: ) Hintze KJ et al, Biol Trace Elemn Res. 3) Aso Y et al, 2010.Diabetes Res Clin Pract. 90(3):250-5

OBESIDAD FERRITINA Sun et al, Endocrinol Metab. Elevados niveles de ferritina se asociaron a mayor riesgo de desarrollo de DMT2 en población China de mediana edad, independiente de la presencia de obesidad. Fumeron et al, Diabetes Care. Niveles de ferritina sérica fue un factor predictivo independiente del incremento de los niveles de insulina plasmática en 3 años en población francesa. Ford et al, Diabetes Care. Datos NHANES reportaron una asociación positiva entre IMC y los niveles de ferritina sérica en hombres y mujeres.

HEPCIDINA  Fernández-Real et al, J Clin Endocrinol Metab. Reportó niveles aumentados de hepcidina y prohepcidina en sujetos con intolerancia a la glucosa.  Jiang et al Diabetes Research. Encontró altos niveles de hepcidina en pacientes DMT2, los que se correlacionaban positivamente con los niveles de ferritina e IL-6.

HEPCIDINA Alteración de la movilización del Hierro: Enterocito Macrófagos Disminución de la captación del Hierro Estado Proinflamatorio Crónico Anemia de la Inflamación Ferritina Saturación de transferrina Hipoferremia Sobrecarga de hierro en macrófagos Nemeth et al, Annu Rev Nutr. 26: Ganz et al, 2009 Semin Hematol. 46(4):

IL-6 TNF-α IL-1 Hep Ft Ferroportina Fe 2+ Fe Ferritina Toledano et al Am J Emerg Med. 27: Zafón et al, Obes rev. 11(4): Nemeth et al, Annu Rev Nutr. 26: IL-1 Hep IL-6 TNF-α

Entonces…… pO 2 HIF-1α TNF-α MIF IL-6 Angiogenesis IRSTir Ser Glut-4 Fos tir GK Hep Ft Hepcidina Fe 2+ ROS Glucosa Mfn2 ROS pO 2 TNF-α IL-6 NF-kB

Caracterizar el metabolismo del hierro, del estado proinflamatorio y de la actividad mitocondrial en Células Mononucleares Periféricas (CMPs) de sujetos obesos con y sin diabetes tipo 2 con inflamación crónica leve. OBJETIVO GENERAL

OBJETIVO ESPECÍFICOS Caracterizar a sujetos obesos y diabéticos tipo 2 con parámetros bioquímicos (glicemia, perfil lipídico, PCR) y de nutrición de hierro (hierro sérico, ferritina sérica, receptor de transferrina). Determinar el contenido de hierro intracelular en CMPs de sujetos obesos con y sin diabetes tipo 2 desafiadas con distintas concentraciones de Fe y/o glucosa. Medir la abundancia relativa de los RNAm de los genes de HIF-1, Hepcidina, NFkB, Mitofusina 2, IL-6 y TNFα de CMPs de sujetos obesos con y sin diabetes tipo 2.

MATERIALES Y MÉTODOS

Metodología: Estudio Clínico 30 Controles (CN) 30 Obesos (OB) 30 Obesos diabéticos (DMOB) Tamaño muestral: Frecuencia de obesidad y diabetes Poder de 80% α = 0.05

Criterios de Inclusión Individuos de sexo masculino, > 40 años, sin ingesta de suplementos de hierro. IMC < 28 kg/mt 2 Circunferencia Abdominal < 100 cm, Glicemias en ayunas < 100 mg/dl IMC mayor a 30 kg/mt 2 Circunferencia Abdominal > 102 cm Obesos: glicemia en ayunas < a 126 mg/dl

Criterios de exclusión Sujetos vegetarianos, bajo tratamiento farmacológico para disminuir de peso, tratamiento con IECAs o bloqueadores de los canales de calcio o aspirina, poseer más de 3 criterios de síndrome metabólico según ATP III, y PCRhs > 3 mg/l Diabéticos: Uso de insulina Diabéticos y Obesos: Uso de IECAs, bloqueadores de los canales de calcio o aspirina. Poseer antecedentes de IAM, angina pectoris o by pass coronario. En ambos grupos ser vegetarianos

30 ml de sangre Parámetros Bioquímicos y nutrición de hierro (12 ml ) Cultivos de CMPs (18 ml) Glicemia Insulina Perfil lipídico: VLDL, LDL, HDL, TG PCRFe sérico Ft sérica RTf Actividad Hem oxigenasa RNA Contenido de hierro

Gradiente de Ficoll Medio RPMI por 20 horas Hierro 5 µM Hierro 40 µM Glu 20 mM + Fe 5 µM Determinación de Fe RNA Obtención de CMPs

Resultados

Controles n= 30 Obesos n= 30 Diabéticos n= 30 P Edad (años)51.6 ± ± ± 5.9NS Peso (Kg)72.7 ± ± 17.3 **92.3 ± 6.7 **p< IMC (Kg/mt 2 )25.8 ± ± 4.5 **31.9 ± 1.8 **p< 0.01 Cir. Abdominal (cm)91.6 ± ± 11.7**106.6 ± 6.9**p< Presión sistólica (mmHg)128.4 ± ± ± 27.5 *p< 0.05 Presión diastólica (mmHg)84.3 ± ± ± 10.2NS Glicemia basal (mg/dl)85.2 ± ± ± 85.6 **p< 0.01 Glicemia pp (mg/dl)87.7 ± ± 65.1p<0.01 Insulina basal (ng/dl)6.5 ± ± 30.4**20.8 ± 10.9**p< 0.01 Colesterol Total (mg/dl)183.5 ± ± ± 51.8NS HDL (mg/dl)33.9 ± ± ± 9.2NS LDL (mg/dl)116.7 ± ± ± 54.8NS Triglicéridos (mg/dl)*164.7 ( ) ( ) ( ) NS Tabla N°1 Características generales de la población estudiada. ANOVA de una vía * p< 0.05; ** p<0.01 Objetivo 1: Caracterizar a sujetos obesos y diabéticos tipo 2 con parámetros bioquímicos (glicemia, perfil lipídico, PCR) y de nutrición de hierro (hierro sérico, ferritina sérica, receptor de transferrina). * Datos expresados como promedio geométrico, entre paréntesis los rangos

Controles n= 30 Obesos N= 30 Diabéticos n= 30 P Hemoglobina (g/dl)16.3 ± ± ± 1.8NS Hematocrito (%)45.7 ± ± ± 6.6NS Ferritina sérica (µg/L) ( ) 67.5 ( ) 95.5 ( )** p<0.01 Fe total (µg/dl) ± ± ± 31.1NS TIBC (µg/dl)327.4 ± ± ± 54.9NS Saturación transferrina (%)30.4 ± ± ± 7.9 *p<0.05 Receptor Transferrina (µg/dl)2.7 ( ) 3.1 ( ) 4.1 ( ) NS TBI (mg/Kg)4.0 ± ± 1.0**7.4 ± 0.5**p<0.01 PCR hs (µg/dl) ( 0.0 – 6.1) 3.0 ( ) 4.1 ( ) ** p<0.01 Tabla N°2 Caracterización de la nutrición de hierro y del estado pro-inflamatorio de controles, DMOB y obesos. ANOVA de una vía * p<0.05; ** p< Datos expresados como promedio geométrico, entre paréntesis los rangos

Figura Nº 1 Concentración de hierro intracelular de CMPs de controles, pacientes DMT2 y obesos, expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa. A) Controles; B) Pacientes obesos; C) Pacientes DMOB. (ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05. **P<0.01) Objetivo 2: Determinar el contenido de hierro intracelular en CMPs de sujetos obesos con y sin diabetes tipo 2 desafiadas con distintas concentraciones de Fe y/o glucosa.

Figura Nº 2: Expresión del RNAm de HIF en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc. (ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos ABC DE F GHI

Figura Nº 3: Expresión del RNAm de Hepcidina en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc. (ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos ABC DE F GHI

Figura Nº 4: Expresión del RNAm de NF-kB en CMPs A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc. (ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos ABC DE F GHI

Figura Nº 5: Expresión del RNAm de IL-6 en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc. (ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos ABC DE F GHI

Figura Nº 6: Expresión del RNAm de TNF-α en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc. (ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos ABC DE F GHI

Figura Nº 7: Expresión del RNAm de Mfn-2 en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc. (ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos ABC DE F GHI

Figura Nº 8: Expresión del RNAm de TLR-2 en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc. (ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos ABC DE F GHI

Figura Nº 9: Expresión del RNAm de TLR-4 en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc. (ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos ABC DE F GHI

Figura Nº 10 Correlación entre los niveles plasmáticos de PCR (μg/dl) y ferritina (μg/L) A) diabéticos, B) Obesos, C) Controles

Figura Nº 11 Correlación entre IMC (Kg/mt 2 ) y niveles plasmáticos de ferritina (μg/L) A) diabéticos, B) Obesos, C) Controles

Figura Nº 12 Correlación entre HOMA y ferritina (μg/L) en sujetos obesos

Tabla Nº3 Correlación entre IMC, PCR y Ferritina y la abundancia relativa de los RNAm de Hepcidina, Nf-Kb, IL-6 y Mfn-2 de sujetos DMT2

Tabla Nº4 Correlación entre IMC, PCR y Ferritina y la abundancia relativa de los RNAm de Hepcidina, Nf-Kb, IL-6 y Mfn-2 de sujetos Obesos

TLR-2 TLR-4 IL-6 IL-1 TNF-α Nf-Kb Diabetes H de C AGS ROS

IL-6 TNF-α Hepcidina Fe NFkB ROS P Fe

Mfn-2 ROSAGEs Inflamación Fosforilación Oxidativa

1. En los pacientes diabéticos obesos se observó un perfil inflamatorio dado por PCRus mayor que en los obesos y en controles. Esto fue reafirmado por la mayor expresión de genes asociados a la inflamación. 2. Tanto el estímulo con Fe como con glucosa produjo una mayor expresión de Nf-Kb y de TLR-2 en diabéticos obesos y en obesos, lo que indujo a una mayor abundancia que genes efectores como IL-6, TNF-α y Hepcidina. 3. Tanto en diabéticos obesos como en obesos se encontró una disminuida expresión de Mfn-2, lo que podría sugerir alteraciones en la actividad mitocondrial de estos sujetos Conclusiones

GRACIAS