Análisis PCR cuantitativo de ADN, ARN y proteínas en la misma célula única A. Ståhlberg, C. Thomsen, D. Ruff y P. Åman Diciembre de 2012 http://www.clinchem.org/content/58/12/1682.full © Copyright 2012 de American Association for Clinical Chemistry

Introducción El valor agregado de los análisis de células únicas Permiten realizar estudios entre diferentes subpoblaciones/tipos de células en una muestra biológica combinada Permiten realizar estudios de heterogeneidad dentro de un tipo específico de células Permiten la detección y el estudio de células poco comunes Ejemplos de aplicaciones para células únicas - Caracterización del destino de las células en la diferenciación de las células madre - Identificación y caracterización de células tumorales en circulación - Caracterización del genotipo y fenotipo de células tumorales

Introducción Técnicas de células únicas (ejemplos) Secuenciación de nueva generación Citometría de flujo Espectrometría de masas Técnicas de hibridización de fluorescencia in situ Microarreglos PCR cuantitativo en tiempo real - Tecnología tradicional con muchos usuarios - Aceptación y conocimientos amplios en la comunidad científica - Puede combinarse con otros métodos - Diversas aplicaciones Consultar editorial adjunto: S. Darmanis, C. Gallant y U. Landegren. PCR-Based Multiparametric Assays in Single Cells (Ensayos multiparamétricos basados en PCR en células únicas). Clin Chem 2012;58:1618-19.

Pregunta 1 ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de las actuales técnicas de células únicas?

Materiales y métodos Muestras - Línea celular de fibrosarcoma humano HT1080 - Expresión ectópica de proteína verde fluorescente con marca fundida en sarcoma (FUS-GFP) usando transfección transitoria Obtención de células - Disociación de células con tratamiento de tripsina - Obtención de células mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) Protocolo libre de purificación - Solución amortiguadora liberadora de analitos - Lisis eficiente de todos los analitos sin inhibición (consultar suplemento para obtener detalles) División de muestras - PLA y RT requieren diferentes condiciones para la ejecución

Diseño experimental Muestra biológica Suspensión en célula única Obtención de células y lisis Figura 1. Esquema del flujo de trabajo experimental para la medición de ADN, ARN y proteínas en la misma célula única. Usamos el 40% de cada célula para el análisis de proteínas, el 40% para el análisis de ARN y el 20% para el análisis de ADN. Ensayo de ligadura de proximidad Transcripción inversa PCR en tiempo real   PCR en tiempo real PCR en tiempo real   Análisis de datos Análisis de datos Análisis de datos  Análisis de ADN Análisis de proteínas Análisis de ARN

Pregunta 2. ¿Cuáles son los cuellos de botella del flujo de trabajo experimental actual?

Resultados Resultado de los ensayos de ARN y ADN Todos los ensayos fueron específicos y sensibles para la detección de todos los analitos en el nivel de célula única, teóricamente al nivel de molécula única En principio, rango dinámico ilimitado Resultado del ensayo de proteínas Específicos y sensibles para detectar proteínas en el nivel de célula única Rango dinámico: ~3 órdenes de magnitud Genera señal de fondo debido a ligadura no específica

Validación de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con prueba de ligadura de proximidad (PLA-qPCR) mediante FACS Figura 3: En donde: GPF low = GPF bajo GPF intermediate = GPF intermedio GPF high = GPF alto Figura 3. Análisis de concentraciones de proteína en células únicas con producción de proteína FUS-GFP variable. (A), Células individuales con diferentes niveles de fluorescencia GFP (ninguna, baja, intermedia y alta) medidas y ordenadas mediante FACS. (B), Análisis de PLA-qPCR de concentraciones de proteína FUS-GFP correlacionados con fluorescencia GFP con medición de FACS (Coeficiente de correlación de Spearman, 0.86. P < 0.001). Tener en cuenta que algunas células sin fluorescencia GFP medidas por FACS demostraron una producción de proteína FUS-GFP sobre aquella de control negativo para proteínas (NPC).

Correlaciones de Spearman entre todos los analitos para todas las células únicas con incremento de la intensidad de fluorescencia GFP Proteína FUS-GFP ADN FUS-GFP mARN ADN/ARN FUS mARN CCND1 mIARN MIR31 ncARN SNORD48 1 0.37** mARN FUS-GFP 0.31** 0.41** ADN/ARN FUS 0.36** 0.44** 0.92** -0.11 -0.29* -0.16 0.10 -0.10 0.02 0.17 0.59** ncARN SNORD48 -0.21 0.07 0.24* 0.71** 0.66** Correlaciones moderadas entre ADN FUS-GFP, mARN y proteína FUS es un factor de transcripción CCND1, MIR31 y SNORD48 son potenciales objetivos descendentes de FUS Tabla 1. Los coeficientes de correlación de Spearman estadísticamente significativos (P < 0.01, y P < 0.05) están marcados (* y **, respectivamente). ADN FUS-GFP indica ADN codificador de FUS-GFP; ARN FUS-GFP indica ARN codificador de FUS-GFP; CCND1 ciclina D1; FUS, fusionado en sarcoma; MIR31, microARN 31; SNORD48, ARN pequeño nucleolar, C/D box 48

Pregunta 3. ¿Cómo pueden utilizarse las correlaciones entre analitos para abordar cuestiones biológicas?

Figura 4. El efecto de la expresión de FUS ectópica Figura 4. El efecto de la expresión de FUS ectópica. CCND1 (verde), miR31 (rojo) y SNORD48 (azul) correlacionadas con (A) FUS endógeno (negro), pero no (B) FUS de expresión ectópica (negro). Al dar por supuesta la ergodicidad, las distribuciones en un punto de tiempo dado pueden observarse como una expresión con el transcurso del tiempo. La correlación positiva entre los ARN puede explicarse, por ejemplo, mediante una regulación de transcripción común.

Conclusiones El ADN, el ARN, y las proteínas pueden medirse de forma precisa en la misma célula única usando PCR cuantitativa. El método descripto es compatible con la mayoría de los enfoques de muestreo celular y genera resultados para el mismo parámetro de todos los analitos medidos, una característica que facilita el análisis de datos comparativo. El análisis de múltiples analitos en la misma célula única ofrece nuevas posibilidades para estudios de correlación detallados.

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