Cromatografía 7° CONGRESO INTERNACIONAL DE QUÍMICOS FARMACOBIÓLOGOS Y XXII JORNADAS CIENTÍFICAS

Definición Técnica analítica de separación de componentes químicos de una mezcla a partir de las diferencias de velocidad a la que son transportados por una fase móvil a través de una fase fija o estacionaria.

Clasificación Columna Plana FE, contenida en tubo estrecho FM, se fuerza el paso de la fase móvil a través de la fase estacionaria Plana FE, contenida sobre una superficie plana o en los poros de una papel FM, se desplaza por capilaridad o por efecto de la gravedad

Cromatografía en columna Se lleva a cabo en tubos de diámetro variado (1cm – 30cm), aunque se puede hacer columnas mucho más amplias o bien reducirlas hasta mm La columna es empaquetada con un sólido finamente dividido y éste debe ser inerte al tubo y a la muestra (no siempre)

Se llevan a cabo equilibrios entre la cantidad de soluto contenido en FM y en FE. FM-S FE-S La capacidad de cada soluto de permanecer en la FM es la que determina el orden de elución de los analitos.

Tipos de cromatografÍa en columna Se tienen varios tipos de cromatografía en columna, los más representativos son: Partición Afinidad Intercambio iónico Filtración en gel

CROMATOGRAMA Inject Where: tR = retention time tM = void time Wb Inject Where: tR = retention time tM = void time Wb = baseline width of the peak in time units Wh = half-height width of the peak in time units

Tiempo de retención ajustado = t’r = tr - tm Cromatograma S E Ñ A L N Í T I C tM =tiempo muerto tR = tiempo de retención Tiempo Volumen Tiempo de retención ajustado = t’r = tr - tm Volumen de retención ajustado = V’r = Vr - Vm

La separación depende de dos factores Peak width & peak position determine separation of peaks

Factores de separación VELOCIDAD DE ELUCIÓN FACTOR DE RETENCIÓN k’ = (tR –tM)/tM o k’ = (VR –VM)/VM

POR DEFINICIÓN k’ Está directamente ligado a la interacción entre un soluto con la fase eStacionaria k’ = moles Astationary phase moles Amobile phase Si k‘ es <1.0, la separación es mala Si k‘ es >30.0, la separación es lenta When 2<k‘<10 la separación es buena

Wb = 4s Wh = 2.354s EFICIENCIA - Picos delgados son mejores ESTA RELACIONADA EXPERIMENTALMENTE AL ANCHO DE PICO - Picos delgados son mejores TEORICAMENTE ESTA RELACIONADA AL PROCESO CINÉTICO DE TRANSPORTE DE LOS SOLUTOS EN LA COLUMNA Wh Wb = 4s Wh = 2.354s Dependent on the amount of time that a solute spends in the column (k’ or tR)

PLATOS TEÓRICOS N = 5.54 (tR/Wh)2 NOS SIRVE PARA ESTIMAR LA EFICIENCIA DE LA COLUMNA O SEPARACIÓN N = (tR/s)2 O TOMANDO EN CUENTA QUE LOS PICOS SON GAUSSIANOS N = 16 (tR/Wb)2 N = 5.54 (tR/Wh)2 Entre más grande sea, se considerá que la columna es capaz de separar un par de compuestos cercanos Mejores separaciones en pequeñas diferencias de retención N es dependiente del largo de la columna

Altura equivalente de plato teórico AEPT=H Compara la eficiencia de separación entre columnas de diferentes longitudes H = L/N where: L = Longitud de la columna N = Número de platos teóricos H can be also used to relate various chromatographic parameters (e.g., flow rate, particle size, etc.) to the kinetic processes that give rise to peak broadening: Why Do Bands Spread? a. Eddy diffusion b. Mobile phase mass transfer c. Stagnant mobile phase mass transfer d. Stationary phase mass transfer e. Longitudinal diffusion

a.) Eddy diffusion – a process that leads to peak (band) broadening due to the presence of multiple flow paths through a packed column. As solute molecules travel through the column, some arrive at the end sooner then others simply due to the different path traveled around the support particles in the column that result in different travel distances. Longer path arrives at end of column after (1).

b.) Mobile phase mass transfer – a process of peak broadening caused by the presence of different flow profile within channels or between particles of the support in the column. A solute in the center of the channel moves more quickly than solute at the edges, it will tend to reach the end of the channel first leading to band-broadening The degree of band-broadening due to eddy diffusion and mobile phase mass transfer depends mainly on: 1) the size of the packing material 2) the diffusion rate of the solute

c.) Stagnant mobile phase mass transfer – band-broadening due to differences in the rate of diffusion of the solute molecules between the mobile phase outside the pores of the support (flowing mobile phase) to the mobile phase within the pores of the support (stagnant mobile phase). Since a solute does not travel down the column when it is in the stagnant mobile phase, it spends a longer time in the column than solute that remains in the flowing mobile phase. The degree of band-broadening due to stagnant mobile phase mass transfer depends on: 1) the size, shape and pore structure of the packing material 2) the diffusion and retention of the solute 3) the flow-rate of the solute through the column

d.) Stationary phase mass transfer – band-broadening due to the movement of solute between the stagnant phase and the stationary phase. Since different solute molecules spend different lengths of time in the stationary phase, they also spend different amounts of time on the column, giving rise to band-broadening. The degree of band-broadening due to stationary phase mass transfer depends on: 1) the retention and diffusion of the solute 2) the flow-rate of the solute through the column 3) the kinetics of interaction between the solute and the stationary phase

e.) Longitudinal diffusion – band-broadening due to the diffusion of the solute along the length of the column in the flowing mobile phase. The degree of band-broadening due to longitudinal diffusion depends on: 1) the diffusion of the solute 2) the flow-rate of the solute through the column

Number of theoretical plates(N) (N) = 5.54 (tR/Wh)2 peak width (Wh) Van Deemter equation: relates flow-rate or linear velocity to H: H = A + B/m + Cm where: m = linear velocity (flow-rate x Vm/L) H = total plate height of the column A = constant representing eddy diffusion & mobile phase mass transfer B = constant representing longitudinal diffusion C = constant representing stagnant mobile phase & stationary phase mass transfer One use of plate height (H) is to relate these kinetic process to band broadening to a parameter of the chromatographic system (e.g., flow-rate). This relationship is used to predict what the resulting effect would be of varying this parameter on the overall efficiency of the chromatographic system. Number of theoretical plates(N) (N) = 5.54 (tR/Wh)2 peak width (Wh) H = L/N

Plot of van Deemter equation shows how H changes with the linear velocity (flow-rate) of the mobile phase m optimum Optimum linear velocity (mopt) - where H has a minimum value and the point of maximum column efficiency: mopt = rB/C mopt is easy to achieve for gas chromatography, but is usually too small for liquid chromatography requiring flow-rates higher than optimal to separate compounds

MEDICIÓN DE LA SEPARACIÓN DE SOLUTOS Factor de Separación o Selectividad Parámetro usado para describir si dos compuestos se separan bien en un sistema cromatográfico. a = k’2/k’1 k’ = (tR –tM)/tM donde: k’1 = the capacity factor of the first solute k’2 = the capacity factor of the second solute, with k’2 >k’1 Un valor de k´1.1 indica que hay una buena separación Does not consider the effect of column efficiency or peak widths, only retention.

tm La retención relativa indica si los picos están separados pero no si están resueltos.

MEDICIÓN DE LA SEPARACIÓN DE SOLUTOS Resolución Es el párametro más comun usado para definir si dos compuestos se separan bien en un sistema cromatográfico.

Señal 2 tiempo Resolución = 0.5

Señal 3 tiempo Resolución = 0.75

Señal 4 Resolución = 1.0 tiempo 6 Señal tiempo Resolución = 1.5

Ejemplos de Fase Reversa

Selección de columnas cromatográficas y sus aplicaciones. Dr. Victor Hugo Abrego Reyes Selección de columnas cromatográficas y sus aplicaciones.

Cromatografía

Definición Técnica analítica de separación de componentes químicos de una mezcla a partir de las diferencias de velocidad a la que son transportados por una fase móvil a través de una fase fija o estacionaria. La capacidad de cada soluto de permanecer en la FM es la que determina el orden de elución de los analitos

Cromatografía en columna Se lleva a cabo en tubos de diámetro variado (1cm – 30cm), aunque se puede hacer columnas mucho más amplias. La columna es empaquetada con un sólido finamente dividido y éste debe ser inerte al tubo y a la muestra (no siempre)

Cromatografía de Líquidos de Alto desempeño HPLC Tipos Cromatografía de reparto Normal o Reversa Adsorción Exclusión (GPC, GFC) Interacción hidrofóbica Interacción Hidrofílica Iónica Quiral

Algunos tipos de analitos

Fases

COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS

Tipos de columnas Fase Normal Fase Reversa (C18, C8, Fenilo)

COLUMNAS BASE SÍLICE Fases antes mencionadas Largos variables 1.0 – 30 cm o más Presiones máximas 5000-6000psi D partícula 3, 5 y 10um pH de trabajo 3-10 T limite a pH bajo 60°C T límite a pH alto 40°C D poro 135 A Volumen de inyección 5 -10 uL

Columnas Poliméricas Mayor resistencia a la presión Altas temperaturas (1) Polystylene (Styrene divinylbenzene copolymer) (2) Polymethacrylate (3) Polyhydroxymethacrylate (4) Polyvinyl alcohol Columnas Poliméricas Mayor resistencia a la presión Altas temperaturas Mejores platos teoricos Aumento en resolución Menor gasto de disolvente Mayor rapidez Menos costo

Polímero v/s Gel de Sílice

Toma de decisiones Grupos de muestras

Grupo A Grupo C Grupo B Grupo D Grupos de Muestras Bajo P.M. Alto Baja Polaridad Alta Bajo P.M. Alto Exclusión por tamaño (Solvente Orgánico) Exclusión por tamaño (Acuoso)

Grupo A Grupo C Grupo B Grupo D Grupos de Muestras Bajo P.M. Alto Baja Polaridad Alta Bajo P.M. Alto Fase Normal Intercambio iónico Exclusión de ión Fase Normal

Grupo A Grupo C Grupo B Grupo D Grupos de Muestras Bajo P.M. Alto Baja Polaridad Alta Bajo P.M. Alto Intercambio iónico

Grupo A Grupo C Grupo B Grupo D Grupos de Muestras Bajo P.M. Alto Baja Polaridad Alta Bajo P.M. Alto Fase reversa

Ejemplos Elección de columnas.

Grupos de Muestras PM > 2000 Baja Polaridad Resinas epoxicas, Policarbonatos. SEPARACIÓN EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS GPC: Columnas SHODEX series K, KD, KF, SB, HFIP, GF- HQ, Exclusión por tamaño (Solvente Orgánico)

Exclusión por Tamaños Fase Móvil: THF, DMF, Cloroformo, Tolueno, etc. Se necesitaa al menos 0% de diferencia en el PM. Fase Móvil: THF, DMF, Cloroformo, Tolueno, etc.

Alto PM/Baja polaridad

Alto PM/Baja polaridad

Grupos de Muestras PM > 2000 Ata Polaridad Polisacaridos, proteínas, polímeros en agua. SEPARACIÓN EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS GFC: Columnas SHODEX series, KW, SB, GS, KS. OH-pak IEC: Columnas SHODEX series IEC, PIKESS, Asahipak, CXPak Exclusión por tamaño Intercambio iónico

Alto PM/Alta polaridad

Alto PM/Alta polaridad

Intercambio iónico (Aniones)

Alto PM/Alta polaridad (carga -)

Alto PM/Alta polaridad (carga +)

Alto PM/Alta polaridad (carga +)

Grupos de Muestras Fase reversa PM < 2000 Baja o media Polaridad Ácidos Grasos, vitaminas liposolubles. SEPARACIÓN Fase Normal / Fase Reversa NPC: Columnas SHODEX series, KW, SB, GS, KS. OH-pak RPC: Columnas SHODEX series IEC, PIKESS, Asahipak, CXPak Fase reversa Exclusión por tamaño Fase Normal Fase Reversa

Separación Fase Normal (NPC)

PM bajo/ baja o media polaridad

Fase Reversa (RPC) SOLVOPHOBIC THEORY

PM bajo/ baja o media polaridad Analgésicos Locales

PM bajo/ baja o media polaridad Antibióticos

PM bajo/ baja o media polaridad Anticonvulsivos

PM bajo/ baja o media polaridad Análisis de aminas sin el uso de pares iónicos. Columna Polimérica

Grupos de Muestras Exclusión por tamaño. HILIC Intercambio iónico PM < 2000 Alta o media Polaridad Ácidos orgánicos, iones inorgánicos, sacaridos, SEPARACIÓN Fase Normal / Fase Reversa NPC: Columnas SHODEX series, KW, SB, GS, KS. OH-pak RPC: Columnas SHODEX series IEC, PIKESS, Asahipak, CXPak Exclusión iónica series SH, KC Exclusión por tamaño. HILIC Intercambio iónico Fase Normal Fase Reversa

Interacción hidrofílica (HILIC) Grupos Aminos Ciano

Separación mediante HILIC Carácter hidrofóbico

Exclusión iónica: Alta o media Polaridad Es contraria a la cromatografía de intercambio iónico. Repulsión por cargas.

Análisis de ácidos orgánicos por exclusión iónica

Intercambio de Ligando: Alta o media Polaridad Azúcares y compuestos ricos en electrones “complejación” con metales unidos a la fase estacionaria. Pb y Zn forman complejos muy estables. J. Braz. Chem. Soc. vol.13 no.5 São Paulo Sept.Oct. 2002

Mecanismo de selección del ligando

Alta o media Polaridad: Azúcares

Alta o media Polaridad: Azúcares

Serie SUGAR… doble mecanismo de separación

Quiral…

Cromatografía de inmunoafinidad

Inmunoafinidad Aplicaciones

Lecture 9 Troubleshooting Sistema y Método

Troubleshooting Localizar el problema en “orden” de probabilidades. No hay procedimientos estándar para resolver problemas en HPLC. Patrón General: Localizar el problema en “orden” de probabilidades. Revisar la causa más problale. Corregir Saltal a la siguiente probabilidad. De qué se trata? Sistema Método

Troubleshooting Sistema Método Estabilidad de flujo Velocidad de flujo Backpressure Taponeamiento Detector Inyección Temperatura Método Velocidad de flujo Tipo de eluyente Composición del eluyente pH Volumen de inyección Temperatura Perfil del gradiente

Parámetros del sistema Verificación preeliminar Solvente Degas bomba automuestrador Columna Detector Reservorio lleno Backpressure Estabilidad de Flujo Revisar las válvulas Viales llenos Revisar conecciones Conexiones de la columna LO Secuencia de Detectores Volúmenes de inyección Conexiones críticas

System Suitability Regla Básica Consejos iniciales. Celda de detección de 20 ml incompatible con columnas con <3 mm D.I Loop de muestra de 10 ml incompatible con columnas <1 mm D.I. micro-inyectores 0.2 ml son inútiles con columnas convencionales Regla Básica Volumen de inyección < Volumen de ceda

HPLC System set up Minimize the volume and connections between autosampler, column, and detector. No guard, no prefilter

Tubing & connections

Back Pressure Importante recordar que la viscosidad aumenta a su vez la P final aplicada.

Automuestreador – Conexiones Columna Bomba Conexión correcta Conexiones equivocadas

Sample Diluent Effect Sample diluent: 1- 50/50 MeOH/Water 2 - 80/20 MeOH/Water 3 - 90/10 MeOH/Water 4 - 95/5 MeOH/Water 5 - 100 MeOH La imcompatibilidad de disolventes puede causar precipitación de la muestra y taponamiento 1 2 3 4 5 Diferentes valores de pH pueden causar picos defectuosos

Sobrecargado de Columna 1 ml 5 ml

Efecto del pH UV-Vis sspH 5.2-9.2 sspH 4.2 sspH 3.2 sspH 1.2-2.2 Abs. Lecture 9 Efecto del pH UV-Vis Chromatographic Conditions Eluent: 90% Aqueous:10% MeCN Aqueous: 15 mM K2HPO4•7H2O adj. to pH 1 - 9 with H3PO4 Flow rate: 1 ml/min Temp: 25oC Abs. sspH 5.2-9.2 sspH 4.2 sspH 3.2 sspH 1.2-2.2 Wavelength (nm)

Effect of pH on Aniline Retention and UV response (220 nm) Lecture 9 Effect of pH on Aniline Retention and UV response (220 nm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Detector Response (mV) wwpH 2 wwpH 4 wwpH 5 wwpH 6 wwpH 9 Time (min.) Chromatographic Conditions Column: 15 cm x 0.46 cm C18 Eluent: 90% Aqueous: 10% MeCN Aqueous: 15 mM K2HPO4•7H2O adj. to wwpH 1.5 - 9 with H3PO4 Flow rate: 1 ml/min Temp: 25oC

Equlibrio de la columna 30 minutos de eluyente Checar la estabilidad de la retención con “estándares probados” inyectando de 3 a 4 veces. Proporciones orgánicas y o acuosas muy elevadas en fase móvil requieren estabilizaciones de columna a 1 ml/min. Mentira que usar solo agua acaba con las columnas...

Gradiente Alta presión vs. baja presión de mezclado mixing J.Dolan, LC-GC V.16 #1, 16

“Method troubleshooting” Problemas relacionados a: Sistema Columna Muestra Fase móvil

Sistema System-to-system compatibility Configuraciones diferentes Volúmenes de permanencia diferentes (conexiones) Sensibilidades de Detectores (marcas) Selección exacta de la longitud de onda Ancho de banda Factores ambientales

Muestra Filtrar y sonicar las muestras Filter Centrifuge Lecture 9 Muestra Filtrar y sonicar las muestras Causa tipicamente taponamiento Filter Centrifuge Algunas veces puede cambiar composición de las muestras Viales Portamuestra Tipos de septas y tapas. Volúmenes de llenado

Secuencia lógica Bomba Automuestreador Detector Algun patrón reciproco en el cromatograma Fluctuaciones en la presión Cambios en la linea base impurezas o contaminación Automuestreador Injection marks (baseline disturbance) Contaminación cruzada Detector Respuesta (linea base ruidosa, sucia, etc.) Wavelength (bandwidth, accuracy, etc.)

Secuencia lógica Cheque siempre la “plomeria” (Bajo flujo, presión, conexiones) Evaluación del cromatograma. 1 1 2 3 1- flow or detection problem 2 – possible injection problem 3 – correct chromatogram

Troubleshooting sequence Analysis of chromatogram Compare con cromatogramas previos Revise la forma del cromatograma Cambios en tiempos de retención Elución reversa?