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Solubilidad Es un balance entre atracciones
Atracciones disolvente-disolvente Atracciones soluto-soluto Atracciones disolvente-soluto Habrá disolución sólo si 3 es mayor que 1 y que 2
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Solubilidad de proteínas y separaciones por precipitación
Solubilidad de proteínas en fuerza iónica baja Precipitación a fuerza iónica alta Precipitación con disolventes orgánicos Precipitación con polímeros Precipitación por afinidad Precipitación por desnaturalización selectiva pH disolventes orgánicos temperatura Scopes, R. K. Protein purification (1994)
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Precipitación a fuerza iónica baja “Salting in”
La solubilidad de las proteínas es resultado de interacciones polares con el disolvente, interacciones iónicas con las sales presentes y fuerzas electrostáticas repulsivas entre moléculas con cargas del mismo signo. + Repulsión Atracción Poca atracción/repulsión en el P.I. entre agregados heterogéneos + - + - + -
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Precipitación a fuerza iónica baja “Salting in”
Este comportamiento es útil en experimentos de diálisis y debe considerarse durante la filtración en gel La precipitación isoeléctrica se puede modificar agregando sales que afecten el pH isoeléctrico
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Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”
El fenómeno de precipitación a fuerza iónica alta depende principalmente de la hidrofobicidad de la proteína Se puede entender como un equilibrio de competencia entre la sal y la proteína por el agua de solvatación
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Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”
La solvatación de una región hidrofóbica es un fenómeno demandante desde el punto de vista entrópico
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Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”
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Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”
¿Por qué (NH4)2SO4? Puntos a considerar Efectividad de la precipitación Interacción directa con la proteína Influencia del pH en la distribución de especies Solubilidad de la sal DHºdis Densidad de la disolución concentrada Precio
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Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”
Serie liotrópica o serie de Hofmeister SCN– < ClO4– < NO3– < Br– < Cl– < acetato < SO42– < PO43– NH4+ > K+ > Na+ ¿Por qué? Hofmeister, F. (1888) Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 24,
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Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”
¿Cuánto pongo?
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Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”
Log S = A - m[(NH4)2SO4]
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Precipitación por disolventes
¿Qué disolventes? ¿Qué hacen los disolventes? ¿Se desnaturalizan las proteínas?
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Precipitación por disolventes
¿Cuánto disolvente?
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Precipitación por disolventes
¿Desnaturalización, la puedo usar?
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Precipitación por afinidad
Agregado lineal formado por un anticuerpo policlonal y una proteína monomérica Agregado lineal formado por un anticuerpo y una proteína dimérica Agregado tridimensional formado por anticuerpos y una proteína tetramérica
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Precipitación por desnaturalización selectiva
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Precipitación por desnaturalización selectiva
Con temperatura
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