DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA PROYECTO DE TITULACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA “Identificación de resistencia a antibióticos en aislados fecales de Escherichia coli procedentes de Cebus albifrons de la parroquia Puerto Misahuallí, Napo-Ecuador” Autora: Haro León Nathalí Carolina Directora: Sarah Martin, Ph.D. Sangolquí, 2019.

Antecedentes Resistencia a antibióticos Muchas bacterias, pocas resistentes Antibiótico Bacteria resistente en mejores condiciones para desarrollo Bacteria transfiere resistencia Bacterias resistentes Población de bacterias susceptibles predomina Población de bacterias resistentes predomina

Antecedentes Resistencia a antibióticos Causas No acabar tratamientos Uso excesivo Uso en actividades ganaderas y asociadas Ausencia nuevos antibióticos Higiene Escherichia coli Fuentes de agua, suelo y vida silvestre

Antecedentes Resistencia a antibióticos en vida silvestre Correlación: Bisontes americanos (Anderson et al., 2008) Aves, zorros, conejos, gatos, ciervos y lobos de Portugal (Costa et al., 2018) Gaviotas (Bonnedahl et al., 2009; Alroy & Ellis, 2011) Mamíferos pequeños canadienses (Allen et al., 2011) Allen et al., 2011; Nhung et al., 2014) Correlación: Resistencia a los antimicrobianos en la vida silvestre y nivel de contacto humano

Antecedentes Resistencia a antibióticos en vida silvestre Kenia (Mureithi et al., 2015) Primates no humanos (NHP) China (Wang et al., 2012) Estados Unidos (Clayton et al., 2014)

Estrategias de salud pública y de conservación de la vida silvestre Justificación Tratar infecciones con microorganismos resistentes requieren alternativas costosas y en ocasiones tóxicas. Prevención Ausencia de investigaciones sobre resistencia antimicrobiana en vida silvestre en Ecuador. Espinoza Alberca (2017) y Janon González (2016) en animales domésticos Medina et al. (2017) en primates neotropicales de Perú Interacción de primates con humanos Estrategias de salud pública y de conservación de la vida silvestre En Ecuador, primer estudio de resistencia a antibióticos en fauna silvestre C. albifrons en Puerto Misahuallí, Napo-Ecuador

Introducción Cebus albifrons Cebus albifrons aequatorialis Casi Amenazada, según la Lista Roja del Ecuador Dimorfismo sexual Diurno Arborícola Gregario 0-2000 m Estable en Amazonía 1100-3300 g Lista Roja de Especias Amenazadas de la UICN Cepas resistentes de Salmonella spp. en heces de C. albifrons

Introducción Antibiogramas Método de difusión en agar o método Kirby-Bauer Incubación a 35-37°C por 16-48 h Discos estandarizados con un antibiótico Zonas de inhibición: R, I, S Concentración mínima inhibitoria (MIC)

Gram negativas: blaTEM, blaSHV, blaOXA o blaCTX-M Introducción Antibióticos Betalactamasas de espectro extendido (BLEE) Gram negativas: blaTEM, blaSHV, blaOXA o blaCTX-M Quinolonas mediada por plásmidos (PMQR) qnrA, qnrB, qnrS, qnrC y qnrD

Introducción Escherichia coli 100X Identificación bioquímica E. coli Prueba Resultado Tinción Gram - Catalasa + Oxidasa Fermentación de carbohidratos Rojo metilo Voges Proskauer Producción de indol Motilidad Utilización de citrato Producción H2S Comensal y patogénica Microorganismo modelo para estudios evolutivos y epidemiológicos Bacterias comensales para analizar propagación de la resistencia a los antibióticos Gram negativa Bacilo 100X

Introducción Identificación del grupo filogenético de E. coli Clermont et al. (2000) A A B1 D D B2 B2 279 pb 211 pb 152 pb Perfil de PCR triplex: dos genes (chuA e yjaA) y un fragmento de ADN anónimo denominado TSPE4.C2.

Introducción Identificación del grupo filogenético de E. coli Clermont et al. (2000) Clayton et al. (2014)NHP

Objetivos Objetivo General Identificar resistencia a antibióticos en aislados fecales de Escherichia coli procedentes de Cebus albifrons de la parroquia Puerto Misahuallí, Napo-Ecuador.

Objetivos específicos Identificar sensibilidades de cada aislado fecal de Escherichia coli a diferentes antibióticos. Tipificar los grupos filogenéticos (A, B1, B2 o D) de cada aislado de Escherichia coli, siguiendo el método propuesto por Clermont et al. Detectar genes de resistencia a antibióticos betalactámicos y quinolónicos en los aislados fecales de Escherichia coli.

Materiales y Métodos Toma de muestra y aislamiento de E. coli 8 primates C. albifrons 5 hembras, 3 machos Colonia presuntiva en Agar EMB 2 muestras por primate, Medio de trasporte Stuart, 4˚C Diluciones en serie de 10 Agar MacConkey

Materiales y Métodos Identificación microbiológica y bioquímica de E. coli Voges Proskauer Citrato de Simmons 100 X Tinción Gram Rojo de metilo Sulfuro, Indol y Motilidad (SIM) Fermentación carbohidratos

AMP10, OT30, N30, GM10, F/M300, FEP30, CXM30, SXT, CIP5, S300, CF30 Materiales y Métodos Prueba de sensibilidad de aislados de E. coli Antibiograma Método de Kirby-Bauer Agar Mueller Hinton 11 antibióticos: AMP10, OT30, N30, GM10, F/M300, FEP30, CXM30, SXT, CIP5, S300, CF30

PCR multiplex por Clermont et al (2000), con ligeras modificaciones Materiales y Métodos Extracción de DNA y tipificación del grupo filogenético 1 μl de colonia Vórtex Baño de agua Sobrenadante PCR multiplex por Clermont et al (2000), con ligeras modificaciones Extracción de DNA por ebullición Baño de agua a 100°C durante 10 min Gen chuA, yjaA, y un fragmento TspE4C2

Materiales y Métodos Detección de genes de resistencia Gen blaCTX-M PCR por Ghorbani-Dalini et al. (2015), modificado. Genes blaTEM y blaSHV PCR multiplex por Monstein et al. (2007), modificado. Gen qnrB PCR por Ranjbar & Farahani (2017), modificado. Electroforesis

Resultados y discusión 1.Sensibilidades de cada aislado fecal de Escherichia coli a diferentes antibióticos, utilizando el método de Kirby-Bauer

Resultados y discusión 76.92% 53.85% 100% 30.77% 38.46% 23.08% 23.08% 15.38% Prevalencia del 81.25% (13/16) de E. coli en las muestras, semejante a Clayton et al. (2014)

N de antibióticos al que resiste Resultados y discusión Perfiles de resistencia a antibióticos hallados en los aislados de E. coli N de antibióticos al que resiste Perfil Prevalencia en % (N) 1 CXMI 7.69 (1/13) 2 CFRCXMI 15.38 (2/13) 3 AMPICRRCXMI CFICIPICXMI 4 OTRCFICIPICXMI AMPRCFRCIPICXMI NICFRCIPICXMI AMPIOTRCFRCXMI 5 AMPIOTRCFRSXTRCXMI 6 AMPI-ROTRCFRSXTRCIPICXMI 38.46%5/13

Resultados y discusión 2. Tipificación de los grupos filogenéticos (A, B1, B2 o D) de cada aislado de Escherichia coli

Resultados y discusión Tipificación de los grupos filogenéticos de E. coli por Clermont et al (2000) M C C A B1 D B1 A D D D: 53.84% (7/13) A y B1: 23.08% (3/13), en ambos casos. Prevalencias

Resultados y discusión Aislados de E. coli fecales de NHP con resistencia o con sensibilidad intermedia fenotípica por grupo filogenético Chakraborty et al. (2015)—>se contrapone

3. Detección de genes de resistencia a betalactámicos y quinolonas Resultados y discusión 3. Detección de genes de resistencia a betalactámicos y quinolonas

Resultados y discusión Detección gen blaCTX-M en aislados de E. coli de NHP M C C Calva et al. (2016) en aislados clínicos de Ecuador  variantes 14 y 15 En Bolivia y Perú en niños sanos Canton & Coque (2006) y Mureithi et al. (2015), relación gen blaCTX-M con ceftazidima y ceftriaxona

Posible transmisión antropogénica Resultados y discusión Detección genes blaTEM y blaSHV en aislados de E. coli de NHP M C C blaSHV blaTEM Gen Prevalencia en % (N) blaTEM 100 (13/13) blaSHV 7.69 (1/13) Calva et al. (2016) Posible transmisión antropogénica

Gen PMQR de mayor frecuencia en Enterobacteriaceae Resultados y discusión Detección del gen qnrB en aislados de E. coli de NHP M C Gen PMQR de mayor frecuencia en Enterobacteriaceae Gen Prevalencia en % (N) qnrB 76.92 (10/13) Mayor distribución del qnrB en ambientes rurales con menor uso de antibióticos en Ecuador Wang et al. (2012) qnrS único gen qnr en E. coli de feca de NHP

Aislados resistentes a antibióticos (N) Genes de resistencia evaluados Resultados y discusión Análisis de los genes de resistencia entre los diferentes aislados de E. coli que mostraban resistencias fenotípicas Resistencia a ampicilina y a cefotaxima, vinculada con el gen blaTEM Aislados resistentes a antibióticos (N) Genes de resistencia evaluados Prevalencia en % (N) AMPR-I + CXMI + CFR (7) blaTEM 100 (7/7) blaSHV CIP (7) qnrB 85.71 (6/7) Fluoroquinolonas deben ser cuidadosamente utilizadas 76.93% (10/13) de qnrB y blaTEM  asociación de los genes PMQR y ESBL

Conclusiones El grupo filogenético de E. coli que se identificó en mayor proporción fue el D, el cual se encuentra en alto nivel en aguas residuales subtropicales y en cepas causantes de infecciones extraintestinales. Las mayores resistencias de E. coli se hallaron a cefalotina, ampicilina, oxitetraciclina, sulfametoxazol/trimetoprima, ya que las bacterias han ido poco a poco diseminando resistencias a fármacos antiguos en la vida silvestre, mientras que presentaron sensibilidad intermedia a cefuroxima y a ciprofloxacina. Se encontró una correlación entre la presencia del gen blaTEM con las resistencia a ampicilina, cefalotina y cefuroxima, y del gen qnrB con la sensibilidad intermedia a ciprofloxacina en aislados fecales de E. coli tomados de NHP del Ecuador. La presencia de resistencia y de genes de resistencia en monos C. alfibrons que habitan el Puerto de Misuallí, Napo-Ecuador, puede provenir de diversas fuentes, principalmente de naturaleza antropogénica, por transmisión zoonótica o por contaminación fecal más que por presiones de selección.

Secuenciación de genes blaTEM, blaSHV, y qnrB. Recomendaciones Susceptibilidad a otros antibióticos como estreptomicina (10 μg), ofloxacina, florfenicol, cloranfenicol, ácido nalidíxico y cefalosporinas de última generación (ceftriaxona). Purificación de los extractos de ADN obtenidos por método de ebullición o extracción de ADN plasmídico. Secuenciación de genes blaTEM, blaSHV, y qnrB. Detección de variedad de genes PQMR: qnrA, qnrS, qnrC, qnrD, aac(6’)-Ib-cr, qepA y oqxAB, y BLEE: blaCMY y blaOXA.

Agradecimientos Dra. Jeanette Zurita Sarah Martin, Ph.D. Alma Koch, M.Sc. Parroquia Puerto Misahuallí, Napo-Ecuador Ing. Elizabeth Minda Ing. Gustavo Echeverría Gabriel Carrillo, M.Sc