Estructura de proteínas, fuerzas que gobiernan el plegamiento De la estructura unidimensional a la estructura tridimensional ● proteínas nativas y proteínas desnaturalizadas ● relaciones estructura-actividad La información para el plegamiento está contenida en la estructura primaria. Las proteínas nativas son estables? ● Christian Anfinsen y la ribonucleasa A Fuerzas que determinan el plegamiento (desde adentro), con una quimotripsina ● enlaces disulfuro ● enlaces iónicos ● enlaces de hidrógeno ● fuerzas de van der Waals Fuerzas que determinan el plegamiento (desde afuera) ● el agua y otros detalles El problema de decidir la estructura correcta ● ¿cuántos disulfuros puedes formar? ● la corta vida de una proteína Para ganar la carrera ● los pequeños motivos de una proteína ● un poco de ayuda: enzimas y chaperonas moleculares 7. Resumen

Bibliografía Anfinsen, C and Scheraga, H. Experimental and theoretical aspects of protein folding. Adv. Prot. Chem 29, 205. Edelhoch, H. and Osborne, J. Thermodynamic Stability of Macromolecules. Adv. Prot. Chem.; 30; 200. Rossmann, M. and Argos, P. Protein Folding. Ann Rev. Biochem. 50; 497. Dressler, D. And Potter, H.; Discovering Enzymes; Scientific American Library, Vol 34. Chap 4. Kolata, G. Trying to crack the second half of the genetic code; Science, 233; 1039. Dobson, C. Evans, P, Radford, S, Understanding how proteins Fold: The Lysozyme Story so far, TIBS, 19, 31 Hartl, F. Hlodan, R. and Langer, T., Molecular Chaperones in protein folding: The art of avoiding Sticky situations., TIBS 19, 20 Hartl, F. and Hayer-Hartl, M. Converging concepts of protein folding in vitro and in vivo. Nature Structural & Molecular Biology 16: 574

Las proteínas se pliegan en forma específica y rápida in vivo apenas son sintetizadas

¿Son estables las Proteínas nativas?

¿Son estables las proteínas nativas? ¿qué quiere decir estable? ¿Qué quiere decir estable? ¿Qué consecuencias tendría una u otra hipótesis?

La información para el plegamiento está contenida en la estructura primaria Christian Anfinsen y la ribonucleasa A

3.- Fuerzas que determinan el plegamiento (desde adentro) Con una quimotripsina Péptido modelo: Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys-Lys-Asn-Gly-Ala-Trp-Thr-Leu-Val-Gly-Ile-Val-Ser Trp Aminoácidos 193-216

Interacciones covalentes Enlace disulfuro Es un enlace covalente Involucra a dos residuos de cisteína Implica el intercambio de dos electrones (es decir, su formación o ruptura es una reacción redox) 2 RSH + Oxidante RS—SR + Producto RS—SR + Reductor 2 RSH + Producto

+ - Interacciones de carga Ion-Ion; Enlace iónico; puente salino Lisina Arginina Amino terminal (Histidina) - Aspartato Glutamato Carboxilo terminal (Cisteína) = constante dieléctrica - vacío: e = 1 - medio apolar: e = 3-5 - agua: e = 78

Interacciones con dipolos Ion dipolo d- d+ el dipolo se orienta y se atrae con una energía:

Interacciones con dipolos Dipolo dipolo d- d+ d- d+ Los dipolos se ORIENTAN y se atraen con una energía: pero además los dipolos se SUMAN

d- d+

Interacciones con dipolos Enlace de hidrógeno. Básicamente es una interacción dipolo-dipolo con un átomo de hidrógeno en el medio d- d+ d- d+ Altamente DIRECCIONAL donador receptor 2.7 Å E = 1-3 kcal/mol

Interacciones con dipolos Enlace de hidrógeno. Un enlace de hidrógeno entre un receptor y un donador tiene múltiples configuraciones posibles, por ejemplo Serina … y todas tienen prácticamente la misma energía Asparagina

Interacciones de van der Waals Son interacciones sumamente DÉBILES entre moléculas. Implican dipolos instantáneos y dipolos inducidos. Dependen (entre otras cosas) del número de electrones de la molécula (P.M.), por ejemplo: CH4 Metano (gas) C8H18 Nafta (líquido) C40H82 Parafina (sólido) Son interacciones de contacto (E α r-6). Están presentes en TODOS LOS CASOS.

Resumen de interacciones Por supuesto que estos son valores promedio y aproximados. Pero destacan la importancia del AGUA Tipo de enlace Energía (kcal/mol) Distancia (Å) En el vacío En agua Covalente 1.5 90 -200 90 Iónico 2.5 80-200 ~ 3 Hidrógeno 3.0 4 1 – 3 van der Waals 3.5 0.1

Los solutos no polares odian al agua por eso se van Versión 2 4. Fuerzas que determinan el plegamiento (desde afuera) El agua y otros detalles (efecto hidrofóbico) ¿Quién odia al agua? Describamos el fenómeno: Un soluto no polar en agua tiende a precipitar, agruparse, huir, etc. Versión 1 Los solutos no polares odian al agua por eso se van Versión 2 El agua expulsa a los solutos no polares porque prefiere estar sola

¿Hay simpatías entre moléculas? 4. Fuerzas que determinan el plegamiento (desde afuera) ¿Hay simpatías entre moléculas? DG = DH -TDS El agua y los solutos van a hacer todo lo posible para que: DH < 0 DS > 0 DG < 0 El efecto hidrofóbico puede entenderse en términos de la energía de Gibbs del sistema

+ DG < 0 4. Fuerzas que determinan el plegamiento (desde afuera) H disminuye (se forman enlaces) S aumenta (se liberan moléculas) DG < 0

4. Fuerzas que determinan el plegamiento (desde afuera) Simpatías entre moléculas Escalas de hidropatías para cadenas laterales de aminoácidos Kyte y Doolittle (1982) Arg Lys Asn Asp Gln Glu His Pro Tyr Trp -4.5 -3.9 -3.5 -3.2 -1.6 -1.3 -0.9 Ser Thr Gly Ala Met Cys Phe Leu Val Ile -0.8 -0.7 -0.4 1.8 1.9 2.5 2.8 3.8 4.2 4.5

4. Fuerzas que determinan el plegamiento (desde afuera) Esta escala no permite predecir estructuras tridimensionales pero da indicios de algunas características mediante mapas de hidropatía Albúmina http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1

4. Fuerzas que determinan el plegamiento (desde afuera) Esta escala no permite predecir estructuras tridimensionales pero da indicios de algunas características mediante mapas de hidropatía Hemoglobina http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1

4. Fuerzas que determinan el plegamiento (desde afuera) Esta escala no permite predecir estructuras tridimensionales pero da indicios de algunas características mediante mapas de hidropatía Citocromo oxidasa http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1

5. El problema de decidir la estructura correcta ¿Cuántos disulfuros se pueden formar? Cisteínas Disulfuros posibles Combinaciones posibles 2 1 4 3 6 15 8 105 10 5 945 12 10395 14 7 135135 16 2027025 34 17 6332659870762850000 46 23 25373791335626300000000000000 ← RNAsa A ← Quimotripsina ← Albúmina sérica ← Inmunoglobulina Edad del universo (s)  432043200000000000

? 5. El problema de decidir la estructura correcta El plegamiento no puede ser un proceso de búsqueda aleatoria. Debe existir un camino secuencial y ordenado para llegar al estado nativo. El “camino” debe proporcionar una ruta RÁPIDA e INEQUÍVOCA hacia el estado nativo. Además, la ruta debe estar codificada en la secuencia de aminoácidos ya que muchas proteínas se pliegan espontáneamente in vitro Secuencia de aminoácidos ? Estructura 3D alguna ayudita

6. Para ganar la carrera Los pequeños motivos de una proteína IN VITRO: El plegamiento de un polipéptido enrollado al azar comienza con la formación de pequeñas secciones de estructura secundaria, como hélices a, giros b, etc., que pueden funcionar como núcleos desde donde el plegamiento se extiende. Los núcleos que tienen la estructura adecuada pueden crecer por la difusión, colisión o adhesión de dos o más núcleos, hasta formar los dominios de la proteína Muchas proteínas se pliegan a su estado nativo en una secuencia ordenada de pequeños “colapsos” que forman “motivos” de la estructura 3D.

6. Para ganar la carrera En proteínas con más de un dominio, estos se pueden juntar para formar un “glóbulo fundido” que tiene la estructura secundaria correcta pero tiene una estructura terciaria desordenada, por ejemplo, puede haber residuos hidrofóbicos expuestos al disolvente.

6. Para ganar la carrera Un poco de ayuda Isomerasas de disulfuros proteicos Isomerasas de prolinas peptídicas cis-trans El plegamiento de las proteínas tiene algunos pasos más lentos como la formación de enlaces disulfuro o la isomerización cis-trans de los enlaces peptídicos de prolina Para acelerar estos procesos hay, por supuesto, enzimas

6. Para ganar la carrera Un poco de ayuda Chaperonas moleculares Proteínas de shock térmico Las chaperonas moleculares inhiben interacciones inapropiadas entre superficies potencialmente complementarias y rompen uniones inadecuadas para facilitar asociaciones más funcionales Las Hsp se unen a cadenas polipeptídicas nacientes cuando van emergiendo del ribosoma. Revierten la desnaturalización y la agregación de proteínas

Netzer, WJ and Hartl, FU; TIBS, (1998) 23: 68

Estructura de proteínas, fuerzas que gobiernan el plegamiento De la estructura unidimensional a la estructura tridimensional ● proteínas nativas y proteínas desnaturalizadas ● relaciones estructura-actividad La información para el plegamiento está contenida en la estructura primaria. Las proteínas nativas son estables? ● Christian Anfinsen y la ribonucleasa A Fuerzas que determinan el plegamiento (desde adentro), con una quimotripsina ● enlaces disulfuro ● enlaces iónicos ● enlaces de hidrógeno ● fuerzas de van der Waals Fuerzas que determinan el plegamiento (desde afuera) ● el agua y otros detalles El problema de decidir la estructura correcta ● ¿cuántos disulfuros puedes formar? ● la corta vida de una proteína Para ganar la carrera ● los pequeños motivos de una proteína ● un poco de ayuda: enzimas y chaperonas moleculares 7. Resumen