PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MÉTODOS – PRINCIPIOS - EQUIPAMIENTO Marzo 2019

CROMATOGRAFÍA Separación diferencial de los componentes de una muestra entre una fase móvil y una fase estacionaria. La fase móvil es el solvente en que se introduce la muestra y con el que se eluyen las proteínas (puede ser el mismo o variar durante la corrida). La fase estacionaria comprende las partículas, en general esféricas, con que se llena la columna. Estas partículas están formadas por una matriz y, en la mayoría de los casos, moléculas de menor o mayor tamaño con las que se la derivatiza, para adaptarla a los diferentes procedimientos cromatográficos. La matriz es el sustrato sólido de la fase estacionaria. Las más comunes son celulosa, dextrano, agarosa, poliacrilamida y silica. Deben tener buena estabilidad mecánica y química, alta capacidad, tamaño y forma adecuada de poros, superficie inerte para minimizar las interacciones no específicas, y tamaño de partícula adecuado al flujo de solvente deseado y a la presión operativa.

CELULOSA DEXTRANO POLIACRILAMIDA AGAROSA

Celulosa La celulosa se forma por la unión de moléculas de β-D-glucosa mediante enlaces β-1,4. Es una larga cadena polimérica de peso molecular variable, con fórmula empírica (C6H10O5)n, con un valor mínimo de n=2000. Tiene una estructura lineal o fibrosa, en la que se establecen múltiples puentes de hidrógeno entre los grupos hidroxilo de distintas cadenas yuxtapuestas de glucosa, haciéndolas impenetrables al agua, lo que hace que sea insoluble en agua, y originando fibras compactas que constituyen la pared celular de las células vegetales.

Celulosa

Celulosa

Agarosa La agarosa está compuesta por una unidad repetitiva que consiste en (d-galactopyranosa unida a través de enlaces 1,3 y 3,6-anidro-α-l-galactopyranosa unida por enlace 1,4) que sufre un proceso de entrecruzamiento térmico.

SEPHACRYL cross-linked copolymer of allyl dextran and N,N’-methylene bisacrylamide

FRACCIONAMIENTO CROMATOGRÁFICO Principio de Separación Tipo de cromatografía Forma y tamaño Filtración por gel Carga neta Cromatografía de intercambio iónico Punto isoeléctrico Cromatoenfocado Hidrofobicidad Cromatografía de interacción hidrofóbica Cromatografía en fase reversa Función biológica Cromatografía de afinidad Antigenicidad Inmunoadsorción Contenido en carbohidrato Cromatografía con lectinas Grupos sulfhidrilos libres Cromatografía covalente Capacidad de ligar metales Cromatografía de quelatos metálicos

PASOS PRINCIPALES EN UNA CROMATOGRAFÍA EMPAQUETADO DE LA RESINA (aunque puede venir la columna ya lista para usar). El tamaño de la columna a utilizar dependerá del procedimiento cromatográfico a seguir y de la cantidad de muestra a purificar. EQUILIBRADO DE LA RESINA SIEMBRA DE LA MUESTRA. La muestra se encuentra resuspendida en un buffer de composición similar al buffer de equilibrado de columna. La aplicación de la muestra a la columna se hace generalmente a través de un “loop”, imprescindible para FPLC o HPLC. En LPLC puede hacerse aplicación manual. LAVADO ELUCIÓN. La elución de las proteínas introducidas en la columna puede hacerse sin cambiar la composición de la fase móvil (elución isocrática) o cambiándola, por etapas o continuamente (gradientes). REGENERACIÓN. Normalmente, luego de la corrida la columna debe ser regenerada, dejándola en condiciones de ser reutilizada. En general si las columnas no se utilizan continuamente deben ser guardadas conteniendo un agente conservador, como el etanol al 20% o la azida sódica, para evitar el crecimiento de microorganismos.

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR El material cromatográfico es un gel en partículas esféricas, de porosidad controlada, sin derivatizaciones. La elución es isocrática. Se usa en general fuerza iónica alta, para minimizar las interacciones de las proteínas entre si, y de las proteínas con la matriz (en este último caso, no relacionadas con el tamaño de poro). La separación de las proteínas se hace en base a la forma y la masa de la proteína. Las proteínas que no penetran en absoluto en los poros del gel son las que salen primero (en el volumen de exclusión o volumen vacío, Vo). Las demás moléculas en la muestra se separan, saliendo últimas las que penetran por completo en las particulas de gel. Los materiales mas comunes son geles de dextrano (Sephadex), de agarosa (Sepharosa), de agarosa y poliacrilamida (Biogel A), de poliacrilamida (Biogel P). En la filtración por gel es crítica la relación entre el volumen de muestra y el volumen de la columna (1 a 5 % del volumen total (Vt) del gel), por lo cual es una técnica que no se puede aumentar en escala mas que hasta un cierto punto. Para desalado de proteínas, se admite hasta un 25 - 30 % del Vt. Aplicaciones: Purificación de proteínas - Desalado - Determinación de pesos moleculares de proteínas nativas

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR https://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ http://www.aklectures.com/lecture/gel-filtration-chromatography https://www.youtube.com/watch?v=S89mAyh6yHU

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Todas las proteínas contienen residuos cargados, positiva o negativamente, y su balance a un determinado valor de pH da la carga neta de la molécula a ese pH. El valor de pH en el que las cargas se balancean, y en consecuencia la carga neta de la molécula es 0, es el punto isoeléctrico de la proteína. Los métodos cromatográficos basados en la carga son dos: 1) La cromatografía de intercambio iónico. 2) El cromatoenfocado.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO La mayoría de las proteínas tienen su pI entre pH 5 y 9. Por encima de su pI la carga neta de la proteína es negativa, y por debajo es positiva. El material utilizado es una matriz derivatizada con grupos cargados positivamente (que intercambian iones negativos, y se llaman por eso intercambiadores aniónicos, como DEAE-celulosa) o negativamente (intercambiadores catiónicos, como CM-celulosa). La adsorción puede hacerse en “batch” o en columna. Las proteínas migrarán en base a su carga neta a ese determinado pH. La elución se hará aumentando la fuerza iónica del buffer (eventualemente también cambiando el pH). Los intercambiadores pueden ser débiles (utilizables cuando la proteína tiene carga elevada a ese pH) o fuertes (cuando la carga es baja). No conviene usar intercambiadores fuertes para proteínas muy cargadas a ese pH, pues la interacción será muy fuerte y la elución más dificil.

GRUPOS INTERCAMBIADORES DE IONES USADOS EN PURIFICACION DE PROTEINAS Fórmula Nombre Abreviatura Aniónico fuerte - CH2N+(CH3)3 Trimetilaminometil TAM - - C2H4N+(C2H5)3 Trietilaminoetil TEAE - Aniónico débil - C2H4N+H3 Aminoetil AE - - C2H4N+(C2H5)2 Dietilaminoetil DEAE - Catiónico fuerte - SO3- Sulfo S - - CH2 SO3- Sulfometil SM - Catiónico débil - CH2 - COO- Carboxi metil CM -

https://www.youtube.com/watch?v=q3fMqgT1do8

Experimento real con hemoglobina en DEAE https://www.youtube.com/watch?v=rH_MgC5rV6Y

Elución por pH Since the net charge on a protein is pH dependent, samples can also be eluted from an IEX medium by altering the pH of the elution buffer. As there is no salt gradient, samples are simply retained on the column at one pH and eluted by increasing or decreasing the pH. The various charged groups in the sample or on the column are titrated until they are neutral or of opposite charge to the medium and the sample elutes. • Proteins bound to an anion exchanger will elute as pH is decreased. • Proteins bound to a cation exchanger will elute as pH is increased. Since pH elution will involve working at pH values close to the isoelectric point of a protein and since many proteins show minimum solubility close to their isoelectric points, precautions must be taken to avoid precipitation on the column.

PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI POR FPLC EN COLUMNA DE MONO Q (INTERCAMBIADOR ANIÓNICO)

CROMATOENFOCADO En cromatoenfocado se forma un gradiente dentro de la columna, mezclando una matriz de intercambio aniónico pre-ajustada a un valor de pH, con un buffer de pH más bajo. La proteína al descender en la columna encontrará valores crecientes de pH; cuando llegue a su pI se volverá electronegativa, y se unirá a la matriz positivamente cargada. Como el buffer sigue corriendo, la proteína se separará y unirá sucesivamente, hasta eluirse en una banda muy definida (“enfocada”) al pH correspondiente a su pI.

AGILENT https://www.youtube.com/watch?v=lp40a7mtc4E

PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI POR FPLC EN COLUMNA DE MONO P (CROMATOENFOCADO)

CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA La mayoría de las proteínas tienen regiones hidrofóbicas en su superficie. Estos “parches” hidrofóbicos se deben a la presencia de cadenas laterales de aminoácidos hidrofóbicos o no polares como Phe, Trp, Ala, Met. Estas regiones hidrofóbicas están dispersas entre regiones más hidrofílicas o polares y su número, tamaño y distribución son una característica específica de cada proteína. La cromatografía de interacción hidrofóbica separa proteínas de acuerdo a sus diferencias en la hidrofobicidad de superficie utilizando una interacción reversible entre las proteínas y la superficie hidrofóbica presente en la matriz.. La interacción entre las proteínas y la matriz se ve significativamente influenciada por la presencia de ciertas sales en el buffer de corrida. Las sales provocan la eliminación de las moléculas de agua que se encuentran ordenadas cubriendo las regiones hidrofóbicas de las proteínas. Así las sales promueven la exposición de las porciones hidrofóbicas facilitando la interacción con la resina. A medida que la fuerza iónica disminuye, la interacción se revierte y las proteínas con el menor grado de hidrofobicidad se eluyen primero. Las proteínas más hidrofóbicas eluyen después requiriendo una mayor reducción en la concentración de sales para revertir la interacción.

CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA Matrices

CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA La cromatografía en fase reversa se denomina de ese modo porque utiliza una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. La fase estacionaria está en general formada por cadenas alifáticas de hasta C18 unidas a una matriz de silica. La fase móvil es un solvente polar como metanol, propanol, etanol o acetonitrilo. Estas condiciones pueden causar la desnaturalización de muchas proteínas. Por ello se las utiliza en general en HPLC en fase reversa (RP-HPLC), para purificar proteínas y péptidos para su secuenciación. Se usan contraiones como el ácido trifluoroacético para asociarse con grupos cargados en la proteína y aumentar su hidrofobicidad.

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Principio: existencia de una interacción reversible entre una proteína y un ligando específico acoplado a una matriz cromatográfica. Algunas interacciones biológicas típicas son: Enzimaóanálogo de sustrato, inhibidor, cofactor. Anticuerpoóantígeno, virus, célula. Lectinaópolisacárido, glicoproteina, receptor de sup celular, célula. Acidos Nucleicosósecuencias complementarias, histonas, polimerasa de ácidos nucleicos, proteínas de unión a ácidos nucleicos. Hormonas, vitaminasóreceptores, proteínas transportadoras. Glutationóglutation-S-transferasa o proteínas de fusión a GST. Iones metálicosóproteínas de fusión a poli (His) fusion, proteínas nativas con residuos de histidina, cisteína y/o triptofano en su superficie. La interacción biológica entre el ligando y el target puede ser resultado de interacciones electrostáticas, hidrofóbicas, fuerzas de van der Waals’ y/o enlaces de hidrógeno. Para eluir la interacción puede ser revertida específicamente utilizando un ligando competitivo, o de manera no específica cambiando el pH, la fueza iónica o la polaridad. La afinidad de la proteína por el ligando debe ser moderada (KL entre 10-4 y 10-8 M) para permitir una buena unión y una disociación ulterior del complejo en condiciones no desnaturalizantes.

Inmunoglobulinas Todas las inmunoglobulinas, independientemente de su especificidad, tienen una estructura común que consiste en cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas idénticas (H), cada una de las cuales está glicosilada; y dos cadenas ligeras idénticas (L) no glicosiladas. La unión entre las cadenas H y L, como así también entre las cadenas H es establecida mediante S-S.

Inmunoglobulinas Utilidad: diganóstica (ELISA, WB, inmunohistoquímica, IFI, FACS), terapeútica (bloqueo de los “checkpoints inmunes”, utilizando anticuerpos monoclonales específicos como anti-CTLA4 o anti-PD1, LLA), investigación.

Ligandos para purificar Acs: Proteína A y Proteína G Alta afinidad por la región Fc de policlonales y monoclonales de tipo IgG. La proteína G y la proteína A son proteínas bacterianas del grupo G de estreptococos y Staphylococcus aureus, respectivamente. Es considerada factor de virulencia por unir a los anticuerpos en una orientación no productiva para opsonización o fagocitosis. Cuando se acoplan a la Sepharose, la proteína G y la proteína A crean matrices de afinidad muy útiles para: purificar anticuerpos monoclonales de tipo IgG, purificar anticuerpos policlonales IgG, purificar complejos inmunes que implican IgG, y proteínas de fusión a proteína A. Las subclases de IgG se pueden aislar de sobrenadantes de cultivos celulares, suero y ascitis.