Cribado molecular de pacientes con sospecha clínica de Síndrome de Lynch. Estudio comparativo de dos métodos para análisis de inestabilidad de microsatélites (IMS). Javier Hernández-Losa1, Stefania Landolfi1, Allan González2, Lluís Catasús2, Carlos Parada1, Miriam Cuatrecasas3, Judith Balmaña4 1,Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Valle de Hebrón. Universidad Autónoma de Barcelona. 2Servicio de Anatomía Patológica Hospital de Sant Pau, Universidad Autónoma de Barcelona. 3Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Clínic, IDIBAPS, Universidad de Barcelona. 4Servicio de Oncología del Hospital Universitario Valle de Hebrón. Universidad Autónoma de Barcelona

HNPCC o síndrome de Lynch: Título: Cribado molecular de pacientes con sospecha clínica de Síndrome de Lynch. Estudio comparativo de dos métodos para análisis de inestabilidad de microsatélites (IMS). HNPCC o síndrome de Lynch: Mutación autosómica dominante en línea germinal de alguno de los genes implicados en MMR. hMLH1 , hMSH2, hMSH6 y PMS2 tipo I : Afectación Colon tipo II: Afectación Ovario, endometrio, estómago, intestino delgado, páncreas, riñón y ureter. Espectro de lesiones cancerosas en colon Esporádico Familiar HNPCC FAP Otros Llompart A, Obrador A, Dolz C. Cáncer colorrectal hereditario. Gastroenterol y Hepatol 1992 ; vol 15 : 7-13. Lynch HT, Smyrk T, Lanspa S, Lynch J. Colonoscopy in relation to the evolving genetics of familial colorrectal cancer. Endoscopy 1995 ; 27 : 43-49

¿ Como detectar pacientes sugestivos de padecer HNPCC? Selección de pacientes para cribado molecular Criterios Clínicos: Amsterdam y Bethesda Criterios Anatomo-Patológicos: Localización, componente mucinoso, componente inflamatorio, células en anillo de sello, etc.. Creación de algoritmos predictivos Flujo de trabajo propuesto: 1) Historia Familiar de cada paciente 2) Análisis por IHQ de los genes reparadores (MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2) 3) Análisis de Microsatélites (Panel referencia) 4.a) Análisis de mutaciones de BRAF o 4.b) Hipermetilación de promotor de MLH1 Secuenciación del gen alterado por IHQ Cribado Eficiente Beneficio para el paciente Disminución angustia paciente Ahorro económico

Microsatelites usados para cribado de cancer colorectal Microsatélites: Secuencias cortas de DNA repetidas y localizadas a lo largo del genoma, generalmente repeticiones de Adeninas. (A)n , (AA)n, (AAA)n, etc…. La inestabilidad de microsatélites es un reflejo de una deficiencia en el sistema MMR Un 3% de Inestabilidad de microsatélites esta ligada al HNPCC Un 12% de Inestabilidad de microsatélites se da en los CCR esporádicos La inestabilidad de microsatélites, tiene papel pronóstico per se además de predecir respuesta a diferentes tratamientos quimioterápicos. Microsatelites usados para cribado de cancer colorectal Boland and Goel A. Gastroenterology 2010; 138:2073-2087

Material y Metodos: 1. Selección de 105 pacientes con CCR, endometrio, ovario y gastrico, que cumplen con criterios clínicos de sospecha de HNPCC. (Amsterdam o Bethesda) 2. Estudio inmunohistoquímico hMLH1 (Clon G168-728 BD Bioscience), hMSH2 (Clon G219-1129 BD Bioscience) y hMSH6 (Clon 44 BD Bioscience). (PMS2 en algunos de ellos) 3. Extracción de ADN correspondientes a a la zona normal y la zona tumoral de cada caso mediante EZ1 DNA Tissue Kit (Qiagen). 4. Análisis de MSI de todos los DNAs con el panel de Promega Corp. 5. Envío de alícuotas de DNA codificadas para el análisis mediante Panel de Bethesda Normal Tumor hMLH1 hMSH2 hMSH6

Material y Métodos: Panel de Promega Corp. Panel de Bethesda. Multiplex con diferentes fluorocromos vs PCR sencillas con FAM Controles de calidad Cantidades de ADN NR24 PENTA-C BAT25 NR21 MONO27 BAT26 PENTA-D Normal Tumor Panel de Promega Corp. Panel de Bethesda.

Resultados: Tabla descriptiva de la serie analizada Comparativa MSI Bethesda vs Promega Comparativa MSI Bethesda vs Promega con IHQ   MSI Bethesda Stable Low High MSI Promega 69 13 8 _ 15

Resultados: Estudios comparativos de las dos plataformas con la Inmunohistoquímica Presencia Ausencia Total Fila MSI Bethesda Negativo 81 (77%) Positivo 8 (8%) 16 (15%) 24 (23%) Total Columna 89 (85%) 105 Inmunohistoquímica Presencia Ausencia Total Fila MSI Promega Negativo 89 (85%) 1 (1%)* 90 (86%) Positivo 15 (14%) Total Columna 16 (15%) 105 Prevalencia = 0.1524 Sensibilidad = 1.000 con IC 95% [0.794, 1.00] Especificidad =0.9101 con IC 95% [ 0.8305, 0.964] Kappa de Cohen: 0.7552 Estadistico de contraste z: -2.8284 p-valor (bilateral) para kappa: 0.002E-3 Prevalencia = 0.1524 Sensibilidad = 0.9375 con IC al 95% [0.697, 0.9984] Especificidad = 1.000 con IC al 95% [ 0.954, 0.964] Kappa de Cohen: 0. 9622 Estadistico de contraste z: 5.7180 p-valor (bilateral) para kappa: 0.0001E-4 * Caso que presenta BRAF mutado en V600E

Resultados: Estudios comparativos de BAT25/BAT26 Kappa de Cohen: 0.8992 Estadistico de contraste z: 5.4885 p-valor (bilateral) para kappa: 0.0004E-4 Ambos casos fueron Positivos para el análisis por IHQ

Conclusiones: El análisis de MSI por el panel de Promega, posee mayores medidas de control de calidad así como una menor cantidad de ADN a consumir en las determinaciones El análisis de MSI por el panel de Promega, posee una mayor especificidad a la hora de seleccionar pacientes candidatos con sospecha clínica de HNPCC