INMUNOHEMATOLOGIA APLICADA

Identificación de anticuerpos irregulares Dr. Carlos Alberto González

Tema 1: Cuándo identificar anticuerpos Tema 2: Para qué sirve identificar anticuerpos Tema 3: Cómo identificar anticuerpos Pre-analítico Analítico Post-analítico

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SOLO SE DETECTA POR REACCIÓN HEMOLÍTICA POST TRANSFUSIONAL No existe ningún método para detectar el error en la identificación de un anticuerpo SOLO SE DETECTA POR REACCIÓN HEMOLÍTICA POST TRANSFUSIONAL

Identificación de anticuerpos irregulares 1) ¿Cuándo hay que identificar los anticuerpos? 2) ¿Para qué sirve identificar anticuerpos? 3) ¿Cómo identificar los anticuerpos?

Identificación de anticuerpos irregulares 1) ¿Cuándo hay que identificar los anticuerpos? Prueba de Antiglobulina Indirecta Negativa Positiva Prueba Cruzada Negativa Si hay registro previo de PAI+ seleccionar GR Antígeno Negativo Identificar el Ac Efecto de Dosis Anti-LebH, -H, -IH Positiva Incompatibilidad ABO Donante PAD+ Ac Baja Incidencia Identificar el Ac Seleccionar GR Antígeno Negativo y cruzar

Identificación de anticuerpos irregulares 1) ¿Cuándo hay que identificar los anticuerpos? 2) ¿Para que sirve identificar anticuerpos? Para asignar significado clínico Para buscar anticuerpos adicionales en aloinmunizados

Identificación de anticuerpos irregulares Anticuerpo capaz de producir: 1) Hemólisis post transfusional 2) Enfermedad Hemolítica Feto Neonatal 3) Daño en el tejido trasplantado Para asignar significado clínico 9

Dr. Carlos Alberto Gonzalez Identificación de anticuerpos irregulares Incidencia: 2 % pacientes 1 o más Ac clínicamente significativos. 98 % NO presenta Ac CS 8,4 % desarrollan Ac entre 2 y 24 sem de transfundido. 76 % son Ac del Sistema Rh (vox sang 1996; 71: 216) Para asignar significado clínico Curso Básico de Inmunohematologia Básica y Aplicada en Medicina Transfusional

Significado clínico de los aloanticuerpos Importantes Solo si + a 37º C A veces Benigno ABO Rh Kell Duffy Kidd S, s, U Vel Lea M, N P1 Lutheran A1 Yta Ge Gya Hy Sda Knops Chido/Rogers Xga HLA/Bg, Csa, Yka, McCa JMH Para asignar significado clínico Curso Básico de Inmunohematologia Básica y Aplicada en Medicina Transfusional 11

Reacción Hemolítica/Serológica Post-Transfusional ISBT Science Series 2012; 7: 54-57

Identificación de anticuerpos irregulares Implicancia en Enfermedad Hemolítica Feto Neonatal Clínicamente no significativo Clínicamente Significativo Leve Severa o Moderada Anti-A1, -Kpa, Anti-M (no activo a 37º C), –N, Anti-P1, -Lea, -Leb, -Lea+b, -Lua, -I Anti-e, -E, -Dib Anti-Fyb, -Jkb, Anti-M, -S,-s, Anti-C, -Fya, -Jka, Anti-M (activo a 37º C), Anti-S, -s,–Dia Anti-D, Anti-c, Ac Sist Kell Para asignar significado clínico

Identificación de anticuerpos irregulares 1) ¿Cuándo hay que identificar los anticuerpos? 2) ¿Para qué sirve identificar anticuerpos? 3) ¿Cómo identificar los anticuerpos? Pre-analítico Analítico Post-analítico

Identificación de anticuerpos irregulares Diagnóstico Tratamiento Etnia Registros previos 3) ¿Cómo identificar los anticuerpos? Pre-analítico

Pre-analítico Autoinmunes, onco, infecc PAD/PAI +; hemólisis Drepanocitosis, talasemia > Frecuencia aloAc Diagnóstico Hipergammaglobulinemia PAD+ no significativa C. GR Campo mixto, RHPT Tx < 3 meses Tratamiento Pl, C pqt, hd PAD/PAI +; discrepancias Drogas PAD/PAI +; hemólisis 16

Pre-analítico Etnia Asociación con fenotipos negativos Registros previos Discrepancias ABO, sensibilización 17

Pre-analítico Etnia Asociación con fenotipos negativos Etnia FENOTIPO FRECUENCIA Afroamericana U- Negativo; Js(b-) 1/100 Fy(a-b-) 68% Americanos / Orientales Di(b-) <1/100 Caucásica K+k-; Lu(a+b-); Co(a-) 1/500 Kp(a+b-) 1/5.000 Polinesia Jk(a-b-) 1 c/110

Dr. Carlos Alberto Gonzalez Pre-analítico Etnia Asociación con fenotipos negativos Frecuencia de fenotipo E-, C-, Fy(a-), K-, Jk(b-) en donantes: 7% caucásicos 93% afroamericanos Curso Básico de Inmunohematologia Básica y Aplicada en Medicina Transfusional

Pre-analítico Etnia Asociación con fenotipos negativos Unidades Incompatibles Anticuerpos más frecuentes Caucásica Afro-americana Oriental Algunas -K, -Lua -K, -Kpa -K, -Dia La mitad -Jka, -Fya, -E -Jka, -E, -Fya La mayoría Rh-: -D Rh+: -c, -Fyb Rh+: -c -c Casi todas -e, -k, -Yta, -Lub -e, -U, -Jsb, -Fy3 -e, -Yta Todas -Kpb, -Vel, -Lan -Hy, -Joa, -Ata -Dib, -Jkab

Desconocido (muestra) Identificación de anticuerpos irregulares Conocido (reactivos) Desconocido (muestra) Pruebas Detección e Identificación de Anticuerpos Paneles globulares Suero Tipificación eritrocitaria Reactivos séricos Hematíes 3) ¿Cómo identificar los anticuerpos? Pre analítico Analítico

Analítico Muestra: Plasma vs suero (tiempo de extracción) Reactivos globulares Poliespecífico vs monoespecíficos Suero Antiglobulina (SAG) MBFI – PEG – ENZ – ALB – CAT – fase sólida Potenciadores

Analítico Paciente transfundido entre (en días) Muestra: Plasma vs suero (tiempo de extracción) Paciente transfundido entre (en días) Muestra a ser tomada antes de transfundir (no más de) 3 -14 24 horas 15 -28 72 horas 29 - 90 1 semana

Analítico Panel selector Panel Identificador Detección de Anticuerpos Muestra: Plasma vs suero (tiempo de extracción) Reactivos globulares Panel selector Panel Identificador Detección de Anticuerpos 2 vs 3 células Células homocigotas Identificación de Anticuerpos 8, 10, 11 o más células Versión extendida del selector

Fenotipo donante 10 tiene 9 antígenos presentes: Panel Identificador Cada frasco del panel corresponde a un donante tipificado para los antígenos mas importantes (mostrado en cartilla) + presencia del antígeno ausencia del antígeno Donantes son Grupo O Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 10 AC Fenotipo donante 10 tiene 9 antígenos presentes: c, e, k, Jka , Fya, Leb, M y s

Panel Identificador Autocontrol Autocontrol vs Prueba de Antiglobulina Directa (PAD) Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 10 AC Negativo Aloanticuerpo Autocontrol Autoanticuerpo Reacción hemolítica post transfusional Positivo Aloanticuerpo GR + suero Campo mixto

Panel Identificador Mismas fases que detección de anticuerpos LIS: Lectura inmediata a temperatura ambiente: IgM 37°: Lectura post incubación a 37o C: IgG o IgM alto rango térmico SAG: Lectura en medio antiglobulina humana: IgG Rh LIS 37º C SAG CC D C E c e 1 + 2 3 4 CC: Control de Coombs

Fase LIS Realizar la lectura inmediata en salino y leer aglutinación, hemólisis (puntuación) Registrar los resultados en su columna: Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+ 2 3 Hasta el ultimo tubo

Negativo 1+ 2+ 3+ 4+ Hemólisis

No deben ser tachadas al excluir. Potencia de las reacciones Fases de reacción Reacción en Fase única Varía c/ ≠ Fase Anticuerpos múltiples Homogénea c/ todas las células Varía c/ ≠ células Efecto de dosis Anticuerpos múltiples IgM + IgG (?) Anticuerpo único Heterocigotas: reacciones Débiles o negativas Homocigotas: reacciones intensas IgM + IgM IgG + IgG No deben ser tachadas al excluir. 32

Fase a 37°C Se continúa con lectura a 37º C y se registran los resultados Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC

Fase SAG Se continúa con prueba de antiglobulina, se registran los resultados Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC

Todas las células negativas en SAG, agregar “Control de Coombs” Fase SAG Todas las células negativas en SAG, agregar “Control de Coombs” Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+  2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC

Aglutinación en 4 tubos … y ahora? Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+  2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC

Interpretación de los resultados Pasos “Exclusión” tachar los antígenos que no reaccionaron Marcar los antígenos no tachados Considerar el medio/fase óptimo de reacción del anticuerpo Buscar la clave patrón

Los individuos NO desarrollan anticuerpos contra sus propios antígenos Interpretación de los resultados Pasos “Exclusión” tachar los antígenos que no reaccionaron Regla de Landsteiner: Los individuos NO desarrollan anticuerpos contra sus propios antígenos

Interpretación de los resultados Pasos “Exclusión” tachar los antígenos que no reaccionaron Un anticuerpo solo reaccionará con eritrocitos que tengan el correspondiente antígeno; los anticuerpos no reaccionarán con eritrocitos que no tengan el antígeno

1. Exclusión Tachar los antígenos que NO REACCIONARON en ninguna fase; y NO tachar los heterocigotas (efecto de dosis) Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+  2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC

2. Marcar los antígenos no tachados Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+  2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC

3. Considerar el medio/fase óptimo de reacción del anticuerpo Anti-Lea es un IgM fría reactiva en LIS. Anti-E es IgG reactivo a 37º C /SAG Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+  2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC

Interpretación: anti-Lea 4. Buscar la clave patrón Anti-E no es patrón y es un Ac caliente Interpretación: anti-Lea Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+  2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC

Regla de 3 Para confirmar el anticuerpo debe cumplirse la Regla de 3 El valor de p debe ser ≤ 0.05 Esto da un 95% intervalo de confianza ¿Cómo demonstrarlo? El suero del paciente debe reaccionar: Positivo con 3 hematíes que portan el antígeno Negativo con 3 hematíes sin el antígeno Usando células adicionales

Regla de 3 1, 4, 7 y 9 son positivas para el antígeno y reaccionan 2, 3, 5, 6, 8 y 10 son negativas para el antígeno y no reaccionan Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+  2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC 4 células positiva 6 células negativas

Tipificación La tipificación del antígeno de los hematíes confirma la especificidad del anticuerpo Realizarlo si el paciente no ha sido recientemente transfundido: Separación de neocitos Biología molecular

Múltiples anticuerpos Procedimientos para identificar múltiples anticuerpos Células adicionales Adsorción (autóloga / homóloga) Neutralización Modificar los hematíes Enzimas proteolíticas Agentes sulfidrílicos AET

Múltiples anticuerpos anti-Jka , anti-S y anti-P1 Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 4+ 2 3 2+ 4 3+ 5 6 7 8 9 10 AC 

Múltiples anticuerpos Células adicionales: anti-Jka, anti-S y descartan anti-P1 Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 4+ 2 3 2+ 4 3+ 5 6 7 8 9 10 AC  #1 #2 #3

GR autólogos si se sospecha autoAc + aloAc Gr con Fenotipo conocido Descartar sobrenadante Elución por calor Dispensar los GR en 3 tubos: 1 2 3 Muestra con Ac múltiples Para absorciones adicionales Centrifugar Detección / Identificación de Anticuerpos Suero adsorbido Prueba Cruzada Incubar Descartar GR 51

Neutralización Sustancias: P1 (líquido de quiste hidatídico) Lea y Leb (plasma y saliva) I (leche materna) Sda (orina) ** Muchas sustancias neutralizan anticuerpos fríos (IgM); que pueden enmascarar IgG clinicamente significativa

Múltiples anticuerpos Anti-K y anti-Fya Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 +  2 3+ 3 2+ 4 5 6 7 8 9 10 AC Patrón anti-Fya

Múltiples anticuerpos Patrón anti-K Anti-K y anti-Fya Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P SAG ENZ SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 +  2 3+ 2+ 3 4 5 6 7 8 9 10 AC Patrón anti-Fya Potenciados por enzimas Desnaturalizados por enzimas Las enzimas remueven el ácido siálico y modifican antígenos

Ac no identificado con panel convencional Homogénea en fases y medios Varía c/ ≠ células Varia c/≠ fases Efecto de dosis 1 célula + Todas las células + adsorción c/ GR de ≠ fenotipo NO SI GR suero vs. Ac hacia Ag Baja incidencia Titular KELL, LU, YT, CO, DI, SC Identificar en sobrenadante y eluído Ac HTLA GR neg Ag alta Incidencia y GR cordón GR ENZ, AET, DTT cloroquina NO SI Tipificación Extendida Inhibición de hemaglutinación Ac hacia Ag alta incidencia Mezcla de Ac Compleja

3) ¿Cómo identificar los anticuerpos? Prueba de antiglobulina indirecta R1R1 y anti-E seleccionar E y c negativo R2R2 y anti-C seleccionar C y e negativo Negativa Positiva Identificar el anticuerpo Prueba cruzada convencional Clínicamente no significativo Clínicamente significativo Anti-A1, -Kpa, Anti-M (no activo a 37º C), –N, Anti-P1, -Lea, -Leb, -Lea+b, -Lua, -I Anti-D, -C, -c, -E, -e Anti-K, -k, -Fya, -Fyb ,-Jka, Jkb Anti-S, -s, U, -M (activo a 37º C) No es necesario tipificar las unidades 3) ¿Cómo identificar los anticuerpos? Tipificar las unidades (aun si en el futuro la PAI es Negativa) Prueba cruzada Post analítico

Post-analítico Unidades necesarias a cruzar Un anticuerpo Paciente con un anti-Jka necesita 4 unidades, ¿cuántas unidades necesito cruzar para encontrarlas? Jk (a+) = 77% Jk (a-) = 23% Si 23 Jk(a-) ……. 100 donantes 4 Jk (a-) ……. X = Se necesitaran probar 17 o 18 unidades para encontrar 4 Jk(a-) 100 x 4 = 17,4 23

Post-analítico Unidades necesarias a cruzar Anticuerpos múltiples Por ejemplo: paciente con anti-K y anti-Jka, necesita 2 unidades compatibles Jk (a+) = 77% Jk (a-) = 23% K+ = 9% K- = 91% Jk(a-) (0.23) x K- (0.91) = 0.20 Jk(a-) y K- 20% de los individuos son Jk(a-) K- Se necesitan 10 donantes al azar para encontrar 2 compatibles

Identificación de anticuerpos irregulares 1) ¿Cuándo hay que identificar los anticuerpos? PAI+ Prueba Cruzada + 2) ¿Para que sirve identificar anticuerpos? Significado clínico Ac adicionales 3) ¿Cómo identificar los anticuerpos? Pre analítico Antecedentes Analítico Exclusión / “regla de 3” Post analítico Cruzar y tipificar GR

Gracias… e-mail del presentador Consultas: soporteemc.mty@serviciositesm.mx