El fundamento de esta técnica consiste en marcar con un fluorocromo, antígenos o anticuerpos, permitiendo observar la localización de proteínas en células.

Presentación del tema: "El fundamento de esta técnica consiste en marcar con un fluorocromo, antígenos o anticuerpos, permitiendo observar la localización de proteínas en células."— Transcripción de la presentación:

1 El fundamento de esta técnica consiste en marcar con un fluorocromo, antígenos o anticuerpos, permitiendo observar la localización de proteínas en células y tejidos, y la presencia de anticuerpos en muestras biológicas

2 La IFD permite poner en evidencia la presencia de Ags específicos presentes en cortes de tejidos o en células en suspensión, inmovilizadas en un portaobjetos de vidrio. La IFI permite identificar la presencia de Acs en muestras biológicas (generalmente sueros) como así también, Ags en células o cortes de tejidos.

3 Aplicaciones Ej. Determinación de Ac anti- Trypanosoma cruzi en suero de paciente

4 Fijación Los fijadores actúan inmovilizando a todos los componentes celulares, generando una impronta más resistente al procesamiento y al almacenamiento. Debe tenerse en cuenta que el tratamiento con fijadores mata a las células y tejidos tratados. solventes orgánicos reactivos de entrecruzamiento Etanol 70% Acetona Metanol Acetona:Metanol 1:1 Paraformaldehído 3-4% Glutaraldehído

5 Controles 1) Autofluorescencia: Pone en evidencia la fluorescencia natural de las células. A esta impronta se le deben aplicar todos los pasos del protocolo salvo las incubaciones con anticuerpos. 2) Isotipo: Pone en evidencia interacciones inespecíficas entre los anticuerpos y las proteínas celulares debido a la especie y/o isotipo de este anticuerpo. Se reemplaza el primer Ac, en el caso de una IFI, por otro de la misma especie e isotipo pero que no presente reactividad contra la impronta. Si se realiza una IFD, debe reemplazarse el anticuerpo utilizado por otro no reactivo marcado con el mismo fluorocromo

6 Controles 3) Inespecífico: Permite identificar si el conjugado se une de manera inespecífica a la impronta. Se procesa siguiendo el protocolo salvo que se elimina la incubación con el primer Ac. Este control se realiza sólo en las IFI. 4) Positivo y Negativo: Para las IFD se emplean importas que contengan o no el antígeno buscado. Si se está analizando la presencia de un antígeno en células o tejidos mediante una IFI, estos controles se realizan del mismo modo que para la IFD. Por el contrario, si la incógnita es la presencia de Ac específicos en un determinado suero, estos controles estarán constituidos por sueros positivos y negativos

7 RIA Radio Inmuno Analisis
Inhibición competitiva de la unión de un Ag radiactivo (trazador) a su Ac especifico, por parte del Ag no marcado. Ac + Ag+ Ag*  AgAc o Ag*Ac El trazador debe poseer una Actividad Especifica alta, a fin de utilizarse en concentraciones de trazas. El Ac debe ser altamente específico, poseer muy alta afinidad y utilizarse en muy baja concentración.

8 Componentes del Radioinmunioensayo (RIA)
Trazador Dilución de Ac elegida • Concentraciones crecientes de Ag frio (Standard) Muestra problema (Mx) Tubo de CT Tubo de unión inespecífica (Ag frío en exceso) Bo (corresponde a la unión máxima, en ausencia de Ag)

9 RIA 1er paso Incubación 2do paso separación Bound/Free 3er paso lectura de tubos con precipitados en detector de radiación gama

10 RIA Alta cc de Ag “frío” Baja cpm en tubo Aplicaciones del RIA
Baja cc de Ag “frío” Alta cpm en tubo Alta cc de Ag “frío” Baja cpm en tubo Aplicaciones del RIA Cálculo de los parámetros de interacción primaria Estimación de las afinidades y capacidad de unión de los Ac Curvas de desplazamiento B/F = Ka.q – Ka.B

11 Comparemos TécnicaSensibilidad del EnsayoInmunodifusión(Oucherlony) 45 ug/ml Aglutinacióndirectae indirecta ug/ml Fijaciónde Complemento ug/ml Contrainmunoelectroforesis ug/ml Inmunofluorescencia ng/ml Enzimoinmunoensayos ng/ml Radioinmunoensayo ng/ml

12 FIN! =)