Conceptos generales, métodos y estrategias en la clonación de fragmentos de DNA Carlos Ríos Velázquez, PhD Departamento de Biología UPR-Mayagüez Crios@uprm.edu 787-832-4040 ext. 2874; C-323

Clonando fragmentos de DNA

Clonando fragmentos de DNA Obteniendo el material genético genómico vectores Enzimas de restricción tipos consideraciones especiales Clonaje la reacción parámetros Detección transformación otras maneras de detección

Monitoreo de transformantes Obteniendo el material genético Muestra ambiental Aislamiento de DNA Clonaje en BAC Transformación en organismo vector Monitoreo de transformantes Extracción directa

Aislamiento de comunidad Amplificación de 16S/18S rDNA Obteniendo el material genético Muestra ambiental Aislamiento de comunidad microbiana Aislamiento de DNA Amplificación de 16S/18S rDNA Clonaje en vector Extracción celular

Obteniendo el material genético Químico/enzimático Lisis alcalina Detergentes agentes caotrópicos lisozima proteinasa K Mecánico “bead beating” sonicación “freeze and thaw”

Obteniendo el material genético DNA genómico A B

Equipo separación DNA genómico de alto peso http://www.bmskorea.co.kr/prod/pulsed_pro03.jpg

Equipo separación DNA genómico de alto peso http://www.nal.usda.gov/pgdic/Probe/v2n3/puls1.gif

Vectores recombinantes: plásmidos Plásmidos: aspectos generales DNA extracromosomal Propio origen de replicación Circulares Número de copias variable

Vectores recombinantes: plásmidos Gen de selección pUC 18 MCS Gen reportero

Vectores recombinantes pBeloBac11 BAC (Bacterial Artificial Chromosome) distintos vectores han sido diseñados para clonar fragmentos grandes de DNA.

Vectores recombinantes pBeloBac11 Gen reportero, para realizar alfa-complementación.

Vectores recombinantes pBeloBac11 Región con sitios de restricción únicos para el clonaje de fragmentos.

Vectores recombinantes pBeloBac11 Genes para partición, selección, regiones para amplificación específica.

Vectores recombinantes pBeloBac11 Genes para partición, selección, regiones para amplificación específica.

Vectores recombinantes pBeloBac11 Genes para partición, selección, regiones para amplificación específica.

Vectores recombinantes

Clonando fragmentos de DNA

Sistemas de restricción y modificación Enzimas de restricción Cortan el DNA en secuencias específicas (target or recognition sequences) Enzimas de modificación (metiltransferasas) Sma I : Serratia marcescens

Sistemas de restricción y modificación Funciones biológicas: Repara daños por agentes externos o errores en replicación. Brinda protección al genoma de la bacteria de ser cortado por sus propias enzimas de restricción. Brinda protección contra DNA exógeno y virus.

Sistemas de restricción y modificación Tipo II Son utilizadas en ingeniería genética y reconocen una gran variedad de secuencias La enzima es solo responsable de realizar el corte, mientras la metilación es realizada por lo otra enzima en la célula. La secuencia de reconocimiento se caracteriza por ser un palíndrome de alrededor de 4-6 bp.

Enzimas de restricción EcoR I 5´ ... G A A T T C ... 3´ 3´ ... C T T A A G ... 5´ 3’ 5’ 5’ 3’ Pst I 5´ ... C T G C A G... 3´ 3´ ... G A C G T C... 5 3’ 5’ 5’ 3’ Sma I 5´ ...C C C G G G... 3´ 3´ ...G G G C C C... 5´ 5’ 3’ 3’ 5’

Enzimas de restricción Consideraciones especiales: Presencia de sitios deseados Número de enzimas Metilación Temperatura

Clonación: componentes Vector Fragmento de DNA Amortiguador Enzima plásmido genómico pH, sales, ATP Ligasa de DNA de T4, topoisomerasas.

Clonación: parámetros Razón de inserto a vector [3:1] visual vs espectrofotometría Dejar en hielo por 30 minutos unión por complementación Incubar a 15oC o/n

Clonación: situaciones Ausencia de sitios de restricción deseados. Necesidad de direccionalidad. Dificultad “blunt” vs “sticky”. Tamaño del fragmento a clonar. otros detallitos…. (metilación)

+(3) + + Clonación: la reacción Un experimento sin controles no es…. Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Effic. +(3) Inserto nada nada nada cortado defosfa. Cortado defosfa. Cortado defosfa.(1) Sin cortar vector + + nada nada ligasa 0…? 0…? 0…? >106 t/ug DNA Bacteria en medio con: (a) antibiótico (b) X-gal

Clonación www.bio.davidson.edu/.../spring99/ bill/ligation.JPG http://www.fermentas.com/profiles/kits/pdovetailkit.htm

Clonando fragmentos de DNA

Expresión, detección y monitoreo de transformantes Transformación. Transfección. Electroporación.

Expresión, detección y monitoreo de transformantes Colony PCR

“white blue screen” X-GAL X + GAL (incoloro) (color)

GFP o genes lux E. coli E. coli-GFP no-fluorescencia fluorescente

GFP o genes lux E. coli E. coli-GFP no-fluorescencia fluorescente

GFP o genes lux 3 4 1 5 2 E. coli E. coli-GFP no-fluorescencia fluorescente

GFP o genes lux 3 3 5 4 4 1 5 2 2 1 E. coli E. coli-GFP no-fluorescencia fluorescente

GFP o genes lux

¿PREGUNTAS? Tarzan X