DNA Recombinante.

Presentación del tema: "DNA Recombinante."— Transcripción de la presentación:

1 DNA Recombinante

2 DNA Recombinante Técnica utilizada para facilitar el estudio de los genes Aislar Amplificar Inserción del gen de interes en otra molécula de DNA que sirve como vector. Molécula de DNA recombinante

3 Historia del DNA Recombinante
Allan Campbell (1962)

4 Historia del DNA Recombinante

5 Historia del DNA Recombinante
Salvador Luria: Resctricción y Modificación Restricción: Fagos solo crecen en un tipo especifico de bacteria. Moficación: Si un fago tiene la capacidad de crecer en dos varios tipos de bacterias. Sistema de Restricción: Arber and otros nucleasa que distingue entre DNA residente o extranjero. Meselson y Yuan caracterizan una enzima que cliva de manera especifica . Enzimas de restricción porque previenen la infeccion viral. Adición de grupos metilo.

6 Historia del DNA Recombinante
Hamilton Smith y otros. Enzimas de restricción clivan secuencias especifícas de DNA Primer uso mapeo del virus SV40 Boyer, Cohen y Berg generan la primera molécula recombinante entre el fago lambda y el virus SV40 1974 se clona el primer gen eucariotico (rDNA)

7 Como Cortar y Pegar el DNA
Enzimas de restricción o endonucleasas de restricción: Reconocen una secuencia específica, corta de nucleótidos en hebra doble DNA denominada sitio de restricción. Enzima Ligasa: Une dos piezas de DNA mediante la formación de enlances fosfodiester.

8 Enzimas de Restricción
Tres clases Tipos de secuencias que reconocen La naturaleza del corte que hacen en la hebra de DNA Estructura de la enzima

9 Endonucleasas Tipo II Actividades de endonucleasa y de metilasa estan usualmente separadas en subunidades diferentes Nomenclatura: Denominadas teniendo en cuenta el organismo en el que fueron aisladas usando un sistema de letras y números. HindIII: Haemophilus influenza, cepa d, número de enzima aislada del mismo tipo

10 Endonucleasas Tipo II

11 Sitios de Reconocimiento de las Endonucleasas Tipo II
Reconocen secuencias simetricas de DNA de 4-6pb Secuencias Palindromicas: secuencia 5’>3’ es la misma de la dirección 3’>5’

12 Sitios de Reconocimiento de las Endonucleasas Tipo II
Terminaciones Escalonados Sticky cohesivos Romos Blunt

13 Sitios de Reconocimiento de las Endonucleasas Tipo II

14 Union y Clivaje del DNA por Enzimas de Restriccion

15 DNA Ligasas Catalizan la formación de un enlace fosfodiester entre el fosfato 5’ de un nucleotido de un fragamento de DNA y el grupo 3’ hidroxilo de otro fragmento Requieren ATP como cofactor Ligasa mas usada es del fago T4

16 DNA Ligasas

17 Clonación Generación de fragmentos de DNA usando enzimas de restricción Ligación de fragmentos de DNA a otra molécula de DNA denominada vector Tranferencia de la molécula recombinante a una célula hospedara Recuperación de los fragmentos de DNA clonados Purificación y Analisis.

18 Clonación

19 Vectores Moléculas transportadoras de DNA
Pueden replicarse de manera independiente Poseen sitios de restricción que estan presentes una sola vez en el vector Poseen un marcador de selección Faciles de recuperar de la célula hospedera

20 Tipos de Vectores/Aplicaciones

21 Plasmidos DNA circulares extracro;:mosomales que tienen un origen de replicación y que se replican de manera autonoma dentro de las bacterias pBR322: p:plasmido, BR: Bolivar & Rodriguez, 322:número de identificación. Poseen un gen de resistencia a antibioticos Poseen un polylinker con multiples sitios de restricción

22 Plasmidos

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25 Plasmidos Transformación: Introducir el DNA
Como evitar la degradación del DNA foreaneo? E. coli DH5 bacterias deficientes en restricción y modificación Selección de Recombinantes:

26 Bacteriofago Lambda  Utilizados para preparar librerias genómicas porque pueden albergar piezas largas de DNA

27 Cromosomas Artifciales
BACs: Bacterial artificial chromosomes YACs: Yeast artificial chromosomes MACs: Mammalian artificial chromosomes Importantes para mapeo y análisis complejos de genomas Pueden incorporar hasta 300kb de DNA foraneo YACs y MACs tienen autonomia replicativa y de segregación en células de mamifero Sistemas regulatorios Pocas copias

28 YACs