REACCIONES DE PRECIPITACIÓN EN GEL INMUNODIFUSIÓN RADIAL

SEROLOGÍA Rama de la inmunología que aplica las interacciones antígeno anticuerpo en el diagnóstico. Tipos de pruebas serológicas Precipitación Aglutinación Fijación del complemento Inmunofluorescencia Radioinmunoensayo Enzimoinmunoanálisis

El anticuerpo y el antígeno soluble que interactúan en una solución acuosa forman un enrejado que por último se convierte en un precipitado visible. Los anticuerpos que aglomeran antígenos solubles se denominan precipitinas.

La formación de un enrejado antígeno- anticuerpo depende de la valencia tanto del anticuerpo como del antígeno. El anticuerpo debe ser bivalente El antígeno debe ser bivalente o polivalente.

Las moléculas libres de antígenos y anticuerpos se unen para formar una especie de malla o grandes agregados moleculares. La formación de estos agregados es el fundamento de la prueba de precipitación.

Normalmente la mayor cantidad de precipitado se forma cuando los antígenos y los anticuerpos que reaccionan entre sí se encuentran presentes en proporciones óptimas, o en concentraciones aproximadamente iguales. Por lo tanto se producen 3 zonas bien diferenciadas, cuando se grafica Ac precipitado vs Ag agregado.

Prozona Exceso de anticuerpo: inicialmente no se forma precipitado. Se forman uniones antígeno-anticuerpo pero son altamente solubles debido al exceso de anticuerpos. La formación de precipitado aumenta conforme la concentración de antígeno.

Zona de Equivalencia Es la zona de máxima precipitación. Cada antígeno esta ligado a un anticuerpo, que a su vez esta ligado por sus otras valencias a otro antígeno formándose de esta forma una gran red que precipita. Por lo tanto es aquella en que la relación Ag-Ac permite la formación de grandes redes de complejos inmunes que precipitan.

Postzona Exceso de antígeno: la adición continuada de antígeno da como resultado la solubilización del precipitado debido a la formación de pequeños complejos con exceso de antígeno. Para una mejor cuantificación del antígeno o anticuerpo es conveniente que la zona de equivalencia sea lo más estrecha posible.

Precipitación en gel Los precipitados inmunitarios no sólo pueden formarse en solución sino también en una matriz de agar. Cuando el antígeno y el anticuerpo se difunden uno hacia el otro en agar, o cuando el anticuerpo se incorpora dentro del agar y el antígeno se difunde hacia la matriz que contiene los anticuerpos, se forma una línea visible de precipitación.

Inmunodifusión en tubos (Método de OUDIN) La primera técnica de inmunoprecipitación. Consiste en llenar un tubo de vidrio con gel de agar en el cual previamente se incorporó un antisuero, y luego aplicar una solución de antígeno dentro del tubo una vez que haya solidificado a 20 grados centígrados. El tubo se mantiene en posición vertical. El antígeno progresa por simple difusión dentro del gel creando un gradiente de concentración

En la mayoria de las técnicas de inmunodifusión se utiliza agarosa en donde se coloca el antígeno y el anticuerpo. Ambos migran en todas las direcciones y cuando se encuentran presentan una banda de precipitación

Se puede aplicar a la dosificación cuantitativa de la concentración de antígeno en una solución basándose en el hecho de que la velocidad de migración sólo depende de la concentración en condiciones estandarizadas. Entonces, basta utilizar concentraciones de antígeno y anticuerpos suficientes para dar lugar a un precipitado cuya densidad pueda medirse por fotometría.

Inmunodifusión radial (Método de MANCINI) Es una prueba por lo general monoespecífico (anticuerpos que reconocen sólo determinantes antigénicos propios y característicos del antígeno a valorar), se encuentran en el gel, mientras que soluciones de diferentes concentraciones del antígeno se siembran en pocillos respectivos. Luego de difundir se formará un halo de precipitación cuyo diámetro será proporcional a la concentración antigénica.

Una vez finalizada la difusión se mide el diámetro de los precipitados que es proporcional a la concentración del antígeno. La concentración de proteína en la muestra biológica se calcula realizando una curva de calibración utilizando muestras patrones de concentración conocida. Midiendo los diámetros de los anillos producidos por cierto número de sueros control (de concentración conocida) podemos construir una curva de calibración.

La principal ventaja, por lo tanto, de la prueba de inmunodifusión simple consiste en que se puede interpretar de manera cuantitativa. En efecto, cuando mayor sea el anillo o mayor sea el número de arcos radiales, mayor será la concentración del antígeno-

Aplicaciones La inmunodifusión radial se utiliza para el análisis cuantitativo y cualitativo de proteínas en suero y otros líquidos corporales. La aplicación clínica más importante de este método es la cuantificación de inmunoglobulinas séricas G, A,y M, los componentes C3,C4 del complemento, Transferrina, presentes en muestras biológicas .

Muchas patologías se pueden detectar mediante la cuantificación de inmunoglobulinas; el titulo de inmunoglobulinas también se una para determinar si un suero es capaz de proteger contra una dosis infectante dada de un virus, si promueve la fagocitosis eficaz de las bacterias, si permite la bacteriólisis mediada por complemento o si neutraliza toxinas, conceptos muy útiles para la elección de determinados sueros en serovacunación y seroprevención

Cuantificación de la proteína S en plasma humano como ayuda al diagnóstico del riesgo trombótico. Fibronectina plasmática total Para detectar anticuerpos anti-ENA y FR.

Difusión doble monodiemensional método de oakley fulthorpe Se coloca en la parte inferior del tubo un volumen de agar 1% fundido, mezclado con un volumen igual del antisuero. Se deja solidificar y se agrega igual volumen de agar 0,5%, se deja solidificar Por último se agrega agar 1% donde se encuentra el antígeno disuelto.

Tanto el antígeno como el anticuerpo migrarán a la zona media de menor concentración, de manera que, otra vez, se formarán gradientes que harán que en determinado punto los reactivos estén en equivalencia y precipiten. Si la cantidad de antígeno está en exceso necesitara recorrer una mayor distancia para alcanzar una dilución tal que se encuentre en equivalencia con el anticuerpo y la banda se formará más cerca del fondo

INMUNODIFUSIÓN DOBLE bidemensional (Método de Ouchterlony) En este método tanto el antígeno como el anticuerpo se difunden radialmente desde los fosos uno hacia otro y por lo tanto se establece un gradiente de concentración. Conforme la equivalencia se alcanza, se produce una línea visible de precipitación, una línea de precipitina.

La posición de la banda de precipitación puede variar de acuerdo a las concentraciones de ambos reactantes, así mismo la comparación de ambas bandas de precipitación formadas por diferentes soluciones de antígenos y una solución de anticuerpo que los reconozca permite sacar conclusiones sobre las similitudes o diferencias antigénicas.

Un inconveniente es esta técnica es su falta de sensibilidad a demás de la gran cantidad de muestra necesaria lo cual hace su uso limitado a ciertos ensayos y utilidades.

APLICACIONES Su mayor utilidad es la de comparar la línea de precipitado entre distintos antígenos. Se puede colocar más de un antígeno en dos pocillos y comparar ambos. Es un método cualitativo. Si la línea de precipitación es continua, los dos antígenos son iguales. Si son distintos tendremos dos redes de precipitado que se cruzan.

Pueden detectar reactividad cruzada o que alguno de los antígenos no se reconozca por el anticuerpo.

La ventaja de estas pruebas es que pueden utilizarse para diferenciar entre antígenos muy parecidos entre sí. Según sea el patrón característico de estos precipitados, se puede determinar el número e identidad de los antígenos o anticuerpos presentes en la muestra. Ej diagnóstico de Histoplasmosis.

Los antígenos idénticos dan lugar a la formación de una sola línea continua, los antígenos totalmente diferentes forman 2 líneas entrecruzadas, los antígenos relacionados, pero no idénticos, forman una línea que presenta una espuela o ramificación.

Práctica Objetivo cuantificar proteínas C3 y C4 del complemento en una muestra suero problema, mediante el método de inmunodifusión radial. La determinación de la cantidad de C4 y C3 dentro de una muestra se realizara de la siguiente manera: Abrir la placa y permitir que se evapore el exceso de humedad.

Sembrar 5 microlitros de muestra. Incubar en posición invertida en cámara húmeda Tiempo de incubación 48 hs Medir los diámetros de los halos Calcular de acuerdo a la curva de calibración

INMUNOELECTROFORESIS

Es una técnica cualitativa, que permite la identificación de diferentes componentes proteicos en distintas muestras biológicas (suero, orina) a través de arcos de precipitación. El método que combina la electroforesis con la inmunodifusión doble. Aquí la mezcla de antígeno se somete primero a electroforesis a fin de separar sus componentes por carga.

A continuación se cortan cuencas del gel de agar paralelas a la dirección del campo eléctrico y se les añade el antisuero. Luego el anticuerpo y el antígeno se difunden uno hacia el otro y producen líneas de precipitación donde se encuentran en proporciones apropiadas.

Aplicaciones Se usa para detectar la ausencia o presencia de proteínas en el suero, útil para determinar si un paciente produce cantidades bajas de uno o más isotipos, características de ciertas enfermedades de inmunodeficiencia. Mieloma múltiple.

Como la inmunoelectroforesis es una técnica estrictamente cualitativa que sólo detecta concentraciones de anticuerpo hasta cierto punto altas, su utilidad se limita a la detección de anormalidades cuantitativas sólo cuando la desviación de lo normal es notable.

Contrainmunoelectroforesis Se utiliza para una detección rápida de la presencia en una muestra de un determinado tipo de antígeno o anticuerpo. Con frecuencia se utiliza en el diagnóstico precoz de infecciones bacterianas graves como la meningitis bacteriana. Para ello, se coloca en un extremo del gel la muestra, en el otro extremo se coloca una suspensión del anticuerpo específico.

Cuando se aplica corriente eléctrica, tanto el antígeno como el anticuerpo se desplazan al extremo opuesto. Si se produce una unión antígeno anticuerpo, se observa una zona de precipitación en la zona ecuatorial del gel, indicando un resultado positivo. La prueba es de gran utilidad para el diagnóstico clínico, ya que los resultados se obtienen al cabo de una hora.

ELECTROFORESIS BIDEMENSIONAL Es una técnica especialmente eficaz para separar mezclas complejas de antígenos o anticuerpos. Se aplica una corriente eléctrica para separar las diferentes proteínas presentes en una mezcla compleja. Después de haberse completado la separación, se cambia la orientación de la corriente. En este momento se separan las proteínas a lo largo de un segundo eje.

El número y localización de los arcos de precipitina nos indica el número e identidad de las diferentes proteínas que se encuentran en la mezcla.

Una técnica cuantitativa relacionada, la electroforesis de cohete, permite medir las concentraciones de antígeno. En esta técnica se somete a electroforesis un antígeno con carga negativa en un gel que contiene el anticuerpo. El precipitado que se forma entre el antígeno y el anticuerpo tiene el aspecto de cohete, cuya altura es proporcional a la concentración de antígeno.

Una limitación de la electroforesis es la necesidad de que el antígeno tenga una carga negativa para el movimiento electroforético dentro de la matriz del agar. Algunas proteínas, como las inmunoglobulinas, no poseen la suficiente carga para analizarse en términos cuantitativos, tampoco es posible medir las cantidades de varios antígenos en una mezcla al mismo tiempo.

FIN