ELECTROFORESIS de Agarosa Dr. Jesús Lee-Borges Dra. Liza Jiménez Dr. José M. Planas Dr. Jose A. Carde-Serrano Universidad de Puerto Rico - Aguadilla

Objetivos Repasar conceptos de preparación, corrida y análisis de Electroforesis Separar los fragmentos de ADN lambda digerido usando electroforésis. Analizarán un gel con ADN cortado con diferentes enzimas de restricción.

¿Qué es la electroforesis de gelatina? Técnica usada para separar una mezcla de fragmentos o moléculas de ácido nucleico a través de un material estacionario (“gel”) en un campo eléctrico.

Historia 1933 - la técnica fue introducida por Tiselius 1959 - el “gel” poliacridamida fue introducida por Raymond y Weintraub 1975 - la electroforesis de dos dimensiones fue anunciada por P. H. O’Farrell Variantes de la misma tecnica Gradientes

Geles comúnmente usados: Agarosa: polisacárido extraído de algas. No tóxico. Poco poder de resolución pero alto grado de separación. Separa fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb. Poliacrilamida: polímero de acrilamida. Neuro-tóxico. Menor grado de separación pero alto poder de resolución. Para fragmentos de DNA de 500 pb. Para separar mezclas de proteínas.

Marcadores de Peso Molecular Son usualmente una mezcla de ADN con pesos moleculares conocidos. Usados para estimar los tamaños de los fragmentos de ADN en una muestra de ADN. Marcadores: usualente mezlca de fragmentos de AND o de proteínas de peso molecular conocido… Para estimar los tamaños de las bandas separadas DNA Markers, High Range, (1Kbp-10Kbp), 2ml, 100 loadings, SM102 DNA Markers, High Range, (1Kbp-10Kbp), 2ml, 100 loadings. DNA markers are ready to load (includes dye and glycerol), and are specifically designed by creating unique restriction sites at precise locations offering 100% accuracy. The DNA markers are highly stable (2 years at 4C) and will not degrade if accidently left at RT. DNA Markers, are available in High (1kbp-10k bp), Medium (125bp-5000 bp) and Low range(250bp-3000bp).

Sistema de Amortiguadores TBE vs TAE TBE: DNA < 1kb Mejor resolución Alta capacidad de amortiguador TAE: DNA > 12 kb Menor capacidad amortiguador Para DNA q se va a recobrar Loading Buffer Continúa. Discontinúa.

Contínua vs Discontínua Concentración de matriz pH

Preparación del “gel” Agarosa

Preparación del “gel” Agarosa (Cont.) Tiene que pesarse y ser mezclada con el disolvente Gel agarosa 0.8% _ g agarosa _ ml 1X TAE

Preparación del “gel” Agarosa (Cont.) Como la agarosa no es soluble con el amortiguador a temperatura ambiente tiene que ser hervida.

Preparación de gel: La mezcla de agarosa y buffer tiene que ponerse a calentar, agitando frecuentemente hasta que llegue al punto donde comience a hervir.

Preparación de gel: Una vez que el frasco con la agarosa ya pueda tocarse sin quemarse, servir con cuidado la mezcla en la bandeja. Añadir el EtBr, 2ug/ul* Colocar la peinilla Dejar que se torne opaco y sólido. Tincion con EtBr* Mayor sensibilidad En la gel En baño RT En las muestras Desteñir en agua (DSN)

Aparato del “gel” Consiste de: bandeja soporte peine

Aparato de “gel” (Cont.) Colocación del “gel” a la bandeja.

Aparato de “gel” (Cont.) El tanque es llenado con amortiguador. 1X TAE

Aparato de “gel” (Cont.) Cuando el gel solidifique y se torne opaco, sacar la peinilla y poner gel en cámara de electroforésis con fosas del lado del polo negativo. Proceder a pipetear las muestras en las fosas. Correr gel.(50V-100V) Teñir con EtBr Tincion con EtBr* Mayor sensibilidad En la gel En baño RT En las muestras Desteñir en agua (DSN)

Práctica de uso de micropipetas: Apoyar brazo con la micropipeta en superficie firme. Utilizar la mano contraria para apoyar la micropipeta Introduzcir punta dentro de fosa, sin tocar el gel Servir el contenido en fosa, presionando botón de la pipeta hasta primer punto de resistencia

Aparato de “gel” (Cont.) El “gel” agarosa es cargado con muestras de ADN.

Organización del gel cargado con λ ADN/Enzimas de restricción Marcador λ DNA uncut λ DNA/BAM HI λ DNA/ECO RI λ DNA/HIN DIII λ DNA/KPN I A B C D E F Marcador λ DNA/Eco RI

Aparato de “gel” (Cont.) Campo eléctrico. 100 V 30-45 minutos

Aparato de “gel” (Cont.) Distancia migratoria.

Aparato de “gel” (Cont.) El “gel”es colocado en un transluminador con luz UV. UV 254 nm para exitar el EtBr y para q este emita a: Exita pero dana el DNA, esta la absorbe el DNA directamtne y la passa al ETBR 305nm, Exita mejor pero hace dano 365nm Hace menos danos al DNA como para clonar, esta la absorbe el tinte como tal no dana el DNA 625 Emite anaranjado

Aparato de “gel” (Cont.) Partículas de ADN. Cortar las bandas Guardar en microtubos rotular

¿Preguntas?

Preguntas TAE vs TBE: para que es el buffer? Que ocurre en los polos? Porque el DNA migra hacia el lado positivo?? Alto voltage vs bajo voltage; afecta? Porque acrilamida en secuenciadores?

Asignación: Calcular tamaños de bandas: 1-1 3-1 6-2 8-2 9-2