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Publicada porIñigo Badilla Modificado hace 9 años
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Práctica Enzimas de Restricción
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Enzimas de restricción Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias Sistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propio ADN bacteriano protegido por metilación. La enzima de restricción corta el ADN no metilado: no propio
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Enzimas de restricción Se han identificado cientos La mayoría reconocen y cortan secuencias palindrómicas Muchas dejan “puntas pegajosas” Se pueden hacer cortes muy precisos del ADN al escoger la enzima Importante en biología molecular: puntas pegajosas se unen con secuencia complementaria
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Palíndrome oso radar reconocer rotor salas seres somos sometemos oro ala ojo
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Secuencia palindrómica en biología 5'- G A A T T C -3' 3'- C T T A A G -5' Locus de ADN en el que la secuencia 5'-a-3' es idéntica en ambas hebras
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Algunas enzimas usadas comúnmente Eco RI 5'-G | AATTC Eco RV 5'-GAT | ATC Hin D III 5'-A | AGCTT Sac I 5'-GAGCT | C Sma I 5'-CCC | GGG Xma I 5'-C | CCGGG Bam HI 5'-G | GATCC Pst I 5'-CTGCA | G
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Uso de enzimas de restricción La actividad depende de condiciones precisas: pH Temperatura Concentración de sales Iones Unidad enzimática (u) es la cantidad de enzima requerida para digerir 1 ug de ADN bajo condiciones óptimas: 3-5 u/ug de ADN genómico 1 u/ug ADN de plásmido Stocks típicamente 10 u/ul
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Tipos corte
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Utilidad para ADN recombinante
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Marcador de peso molecular Permite identificar tamaño (peso) aproximado de moléculas en un gel A menudo es ácido nucleico digerido con enzima de restricción Común: fago lambda digerido con HindIII: da 5 bandas O la escalera de 1kb
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Plásmidos en gel
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Electroforesis de plásmidos Plásmido sin cortar puede tomar 5 conformaciones No se puede determinar el tamaño de un plásmido no cortado. Si se corta con ER que corte en un sitio: se lineariza
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Digestión plásmidos Número bandas= número de sitios de restricción pGEM-TpGEM-T/EcoRI pUWL201 pUWL201/EcoRI
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Digestión ADN genómico
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Diagnóstico deleciones/inserciones por electroforesis
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Deleción en FQ Fibrosis quística Recesiva Deleción 3pb en gen CFTR, 70% de casos Degradada en RE, no llega a membrana celular
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Diagnóstico por sitios de restricción
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Mutación: Cys282Tyr Mutación Hemocromatosis
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Mutación: His63Asp Mutación Hemocromatosis
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http://www.protocol- online.org/prot/Research_Tools/Online_To ols/Restriction_Digestion/index.html
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Lambda cortado con EcoRI 5 cortes
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Lambda cortado con Eco RI 6 fragmentos
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Práctica Digestión del fago Lambda con tres enzimas de restricción
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