BIOTRANSFORMACIONES ENZIMATICAS INDUSTRIALES procesos químicos más ó menos complejos MAS VENTAJAS A NIVEL INDUSTRIAL... condiciones medioambientales muy suaves ( moléculas lábiles, centro de trabajo, medio ambiente) menos pasos de purificación (especificidad) menos subproductos MAS REQUISITOS... conversiones cuantitativas actividad y estabilidad del biocatalizador reduccion de inhibición por substratos y productos estereoespecificidad, regioselectividad total eliminación de reacciones laterales

+ E SINTESIS TERMODINAMICAMENTE CONTROLADA DE ANTIBIOTICOS Cefalotina Tienilacético 7 - ACA + E H + 3 N R ' O R - C - O- + H+ O R - C - OH DISOLVENTES Keq = [ RR’ ] [ H2O ] [ ROH ] [ R’NH2 ]

100 100 100 14 EFECTO DE CODISOLVENTES SOBRE DIFERENTES DERIVADOS DE DIFERENTES ACILASAS ACTIVIDAD ESTABILIDAD EN 50% DMF 20 40 60 80 100 100 100 100 K.citrophila Actividad relativa (%) Actividad Residual (%) E. coli 14 E. coli 15 30 45 60 75 Hidrólisis. Penicilina G pH 8, 37ºC Síntesis. Penicilina G pH6,5 , 50% DMF, 4ºC Tiempo ( horas ) K. citrophila E.coli Acetato sódico 10 mM pH 5, 25ºC

[ codisolvente] = 50% RCOOH + H2NR´ RCONHR´ RCOO- + H+ RCOOH DMF EFECTO DE LOS CODISOLVENTES SOBRE LOS RENDIMIENTOS DE STC PENICILINA G EFECTO DE LOS CODISOLVENTES SOBRE EL pK DE LOS ACIDOS CARBOXILICOS DMF Butanodiol RENDIMIENTO (%) Glicerina Tampón pH Acetonitrilo Acetona Dioxano DMF Metanol Butanodiol Etanol Glicerina Etilenglicol RCOOH + H2NR´ RCONHR´ [Sustratos] = 10 Mm , T= 4ºC [ codisolvente] = 50% RCOO- + H+ RCOOH

Rendimiento de Síntesis EFECTO DE DIFERENTES CODISOLVENTES ORGANICOS EN EL pK DE LOS ACIDOS CARBOXILICOS Y RENDIMIENTOS DE SINTESIS DE PENICILINA G EN CONDICIONES STANDARD Codisolvente pK Rendimiento de Síntesis Tampón 50% Acetona 50% Dioxano 50% DMS 50% DMF 50% Celosolve 50% Tetraglime 4.2 5.35 5.5 5.8 5.4 2% 53% 55% 56% 50%

GENERACION DE MICROAMBIENTES ARTIFICIALES EN EL ENTORNO DE LA PROTEINA Coinmovilización de polímeros hidrofílicos Modificación con polímeros hidrofílicos

EFECTO GLOBAL DE LA ESTABILIZACION DE PGA 100 90% tetraglime 80 60 70% tetraglime 55% dioxano Actividad Residual, (%) 40 20 50% dioxano 20 40 60 80 100 pH 6.5, 4ºC Tiempo, (horas)

Síntesis de Cefalotina DISEÑO DEL CATALIZADOR DEL MEDIO DE REACCION FUENTE ENZIMATICA Productividad: 6Kg / l / día Estabilidad derivados: Actividad > 90% después de dos meses Hidrólisis inespecífica 7- ACA < 1%

DISEÑO DE BIOTRANSFORMACIONES ENZIMATICAS SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA DE ANTIBIOTICOS - LACTAMICOS CATALIZADA POR PENICILINA ACILASAS INMOVILIZADAS

Solubilidad / Estabilidad DISEÑO DE BIOTRANSFORMACIONES Actividad Biocatalizador Estabilidad Solubilidad / Estabilidad Reactantes Toxicidad Medio Subproductos Rendimientos Derivados Medios de reacción Substrato Propiedades catalíticas: Enantioselectividad Regioselectividad Especificidad Inhibiciones

FLEXIBILIDAD ESTRUCTURA ENZIMATICA pH / T / [ cosolvente ] Propiedades Catalíticas Subóptimas Selectividad x Especificidad x Optimas Selectividad y Especificidad y FLEXIBILIDAD ESTRUCTURA ENZIMATICA

Actividad / Estabilidad PARAMETROS DE INTERES Actividad / Estabilidad Hidrólisis Sencillas Resolución de Mezclas Racemicas Biosensores Protección ó Desprotección Selectiva Inhibición Por S ó P Estereoespecificidad Especificidad Regioselectividad

SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA OR’ R C O NH R’’ S + NH2 R’’ + R’ OH E h1 h2 RCOOH + R’OH + NH2 - R’’ CONDENSACION MUY SELECTIVA EN CONDICIONES MUY SUAVES Transamidaciones Transesterificaciones Ester amido Amido ester Transglicosilaciones

LA SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA ALGUNOS PARAMETROS QUE DEFINEN LA SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA

1.- Saturación del Centro Activo de la Enzima por el Nucleófilo H2O SINTESIS HIDROLISIS [ nucleófilo ] S / h

2.- Tasa Máxima Síntesis / Hidrólisis H2O A s / h [ nucleófilo ]

3.- Tasa Síntesis / Hidrólisis del Producto OH R C O OMet NH R’ OMe NH 2 - R’ [ P ] tiempo

OPTIMIZACION DE LA SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA tiempo s / h [ nucleófilo ]

DIFERENTES ENZIMAS adsorción nucleófilo tasa s / h1 tasa s / h2 E. coli K. citrophila adsorción nucleófilo tasa s / h1 tasa s / h2 estabilidad actividad DIFERENTES ENZIMAS

DIFERENTES DERIVADOS adsorción nucleófilo tasa s / h1 tasa s / h2 estabilidad actividad DIFERENTES DERIVADOS

DISEÑO MEDIO DE REACCION Actividad Estabilidad Adsorción Nucleófilo Tasa s/h1 Tasa s/h2 Efecto Fisico - Químico 2 1 ionización substratos fuerzas electrostáticas fuerzas hidrofóbicas

SISTEMAS BIFASICOS E + E fase 2 fase 1 RCOOH + MetOH + NH2 - R’ NH2 R’ OMe NH R’ + E h1 h2 S R C O OMet NH2 - R’ E NH R’ fase 2 fase 1

+ SINTESIS DE ANTIBIOTICOS LACTAMICOS D - Phegly 7 ACA Cefaloglicina Activación grupo carboxilo cadena lateral Protección grupo carboxilo anillo antibiotico Protección grupo amino D- Phegly Utilización bajas temperaturas Utilización medios muy contaminantes Utilización reactivos muy tóxicos Necesidad de utilizar compuestos puros D - Phegly 7 ACA Cefaloglicina O C N H 2 + CH2 - O - C - CH3 S NH2

+ SINTESIS ENZIMATICA DE ANTIBIOTICOS PGA D - Phegly 7 ACA VENTAJAS No es preciso proteger los grupos que no se desea que reaccionen La reacción transcurre en condiciones poco contaminantes La presencia de contaminantes no activados no deberia producir subproductos Posibilidad de utilizar mezclas racémicas de donadores de acilo Posibilidad de utilizar el núcleo sin purificar C O CH2 - O - C - CH3 S N H 2 R Cefaloglicina NH2

+ + SINTESIS TERMODINAMICAMENTE CONTROLADA E E 40-60% DMF pH 6-7 + CH2 C O H NH2 R CH2 C NH O R E 90-95% DMF pH 8-9 + CH C O O H NH2 R CH C H2 R O N E NH3+ NH2 PA capaces de reconocer grupos cargados PA activos y estables en 90 / 95% DMF

SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA DE ANTIBIOTICOS S N O R COOH H 2 S C H N 2 O COOH S R C O M e H N 2 + PGA h1 h2 S N O R COOH H 2 C H N 2 COOH + MeOH + tasa s / h1 Adsorción nucleofilo Actividad Estabilidad

MECANISMO CATALITICO DE PENICILINA G ACILASA Análogos Fenilacético CH2 SO3 O OH CH2 SO3 F PMSF otros inhibidores serina PGA inhibida OH PGA NO inhibida

Vh1 Vs S / h1 D- MandOMe L - ManOMe D - PheglyOMe L - PheglyOMe 100% EFECTO DEL DONADOR DE ACILO SOBRE LAS PROPIEDADES CATALITICAS DE PENICILINA G ACILASA Síntesis Cineticamente Controlada Vh1 Vs Hidrólisis en ausencia de Nucleofilo S / h1 D- MandOMe L - ManOMe D - PheglyOMe L - PheglyOMe 100% 25% 250% 5,7% 5% 3% 2,5% 66% 40% 20% 1,8 18 1,6 1,5 pH7, 100mM 6APA, 50mM ester 100% = Actividad con D-MandOMe

+ A B D EFECTO DEL DONADOR DE ACILO EN LAS PROPIEDADES DE PGA DE E.coli Centro Activo Diferentes Donadores de Acilo Diferentes Aperturas del Centro Activo OH C COOMe R ' + A B D

OPTIMIZACION DE LA TASA SINTESIS / HIDROLISIS DEL ESTER Sintesis de Derivados del ácido D - mandélico

6,3 6,1 1,7 6 20% 100% 15% 40% SINTESIS DE DIFERENTES ANTIBIOTICOS tasa s/h1 tasa s / h2 7 ACA 7 ADCA 6 APA 6,3 6,1 1,7 6 20% Actividad Residual 100% 15% 40% SINTESIS DE DIFERENTES ANTIBIOTICOS pH 7, 4ºC, 25mM D - MandOMe, 50mM núcleo antibiótico

EFECTO DEL pH Tasa S / h1 [ 6APA ] mM 1 2 3 4 100 250 500 pH 7 pH 6,5 1 2 3 4 100 250 500 pH 7 pH 6,5 pH 8 Tasa S / h1 [ 6APA ] mM

EFECTO DE LA TEMPERATURA 4 4ºC 37ºC 3 2 Tasa S / h1 1 100 200 300 400 500 [ 6APA ] mM

EFECTO DE LA FUERZA IONICA 1 2 3 4 5 6 100 200 300 400 500 [ 6APA ] mM Tasa S / h1 50mM fosfato 1M SO4 (NH4)2

EFECTO DEL METANOL 40% 20% 0% Tasa S / h1 [ 6APA ] mM 1 2 3 4 5 6 500 1 2 3 4 5 6 500 50 100 175 250 0% 20% 40%

+ SINTESIS QUIMICA DE CEFAMANDOL Cefalosporina C 7 ACA 7 ACA - TM COOH N S O C H 2 3 Cefalosporina C 7 ACA hidrólisis Purificación Modificación 7 ACA - TM Acido Adípico + Condensación CEFAMANDOL SINTESIS QUIMICA DE CEFAMANDOL Cefamandol

+ SINTESIS QUIMICO-ENZIMATICA DE CEFAMANDOL Glutárico Mandelil 7 ACA COOH S N O C H 2 3 CEFAMANDOL Cefalosporina C DAO Glutaril Acilasa PGA Condensación 7 ACA Glutárico + Modificación Química Mandelil 7 ACA Mandelil 7ACA Mayor solubilidad del núcleo antibiótico Mayor velocidad de reacción Ahorro de purificación SINTESIS QUIMICO-ENZIMATICA DE CEFAMANDOL

( Síntesis de 7ACA - Mand ) ( Síntesis de 7ACA - Mand ) INFLUENCIA DEL DERIVADO. PREPARACION 2 4 6 8 tasa s / h1 ( Síntesis de 7ACA - Mand ) 20 40 60 80 100 Actividad Residual ( Síntesis de 7ACA - Mand ) pH 7, 4ºC

( Síntesis de 7ACA - Mand ) ( Síntesis de 7ACA - Mand ) INFLUENCIA DEL DERIVADO. PREPARACION 8 20 40 60 80 100 6 4 2 tasa s / h1 ( Síntesis de 7ACA - Mand ) Actividad Residual ( Síntesis de 7ACA - Mand ) pH 7, 4ºC

Tasas Síntesis / Hidrólisis ELECCION DEL DERIVADO. FUENTE MICROBIANA pH 7, 50mM 7ACA, 25mM Ester Tasas Síntesis / Hidrólisis ( 7ACA - Mand ) 2 4 6 8 E. coli K. citrophila Actividad Residual 20 40 60 80 100

OPTIMIZACION DE LA TASA SINTESIS / HIDROLISIS DEL ANTIBIOTICO SINTESIS DE CEFALOGLICINA

CEFALOGLICINA: ANTIBIOTICO PRECURSOR DE OTRAS CEFALOSPORINAS PGA H N S 2 O C H C O O M e + N O C C H C H C O N H S N H O C H 2 2 3 N H COOH 2 N O C H D-Fenilglicinato de Metilo O C H 2 C 3 7 ACA Cefaloglicina COOH O Otras Cefalosporinas C H N 2 COOH + MetOH S O 3

CURSO TEORICO Y REAL DE LA SINTESIS DE 10 20 30 40 50 [Cefaloglicina] producción (mM) [Fenilglicinato de metilo] consumido (mM) CURSO TEORICO Y REAL DE LA SINTESIS DE CEFALOGLICINA

Exceso de donador de acilo activado ESTRATEGIAS PARA REDUCIR LA HIDROLISIS DEL ANTIBIOTICO Exceso de donador de acilo activado Condiciones donde la tasa actividad esterasa / actividad amidasa sea mayor Distorsión del centro activo de la enzima

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE DONADOR DE ACILO 20 40 60 80 100 200 300 400 500 1000 2000 3000 4000 5000 [Fenilglicinato de Metilo], (mM) Rendimientos de Síntesis, (%) Actividad Sintética Inicial U / ml EFECTO DE LA CONCENTRACION DE DONADOR DE ACILO EN LOS RENDIMIENTOS Y EN LA VELOCIDAD INICIAL DE SINTESIS

ACTIVIDAD HIDROLITICA PGA 20 40 60 80 100 4 5 6 7 8 9 Actividad Relativa % ACTIVIDAD HIDROLITICA PGA pH CH C O OMe NH2 CH2 NH - R’ NH R’

DISEÑO DEL REACTOR Sistemas Bifásicos

ELIMINACION CONTINUA DE PRODUCTO SISTEMAS BIFASICOS ELIMINACION CONTINUA DE PRODUCTO Fase 2 RCONH - R’ R COOMe + R’ - NH2 R CONH - R’ E Fase 1 R COOH + R’ NH2 + Me OH

E SISTEMAS BIFASICOS AGUA / DISOLVENTE Disolvente inmiscible H C S R H+ 3 O- Fase acuosa E

SISTEMAS BIFASICOS ACUOSOS FASE APOLAR ( POLIETILENGLICOL ) H H2N S C CO N H S N NH2 N CH2R O CH2R O C O OH C O OH H H2N C CO N H S S N NH2 N CH2R CH2R O O C O OH C O OH FASE POLAR (SALINA, DEXTRANO)

SISTEMA BIFASICO PEG 600 / SULFATO AMONICO constantes de reparto Conc.PEG Conc. (NH4)2SO4 Reparto Cefalexina 7ADCA 100% 80% 60% FGM Ester FGAmida 3M 23,0 3,2 2M 9,4 3,1 6,1 2,1 4,5 2,0 4,0 1,8 3,0 1,6 7,5 6,9 5,0 2,2 1,2 1,1 1,4 1,45 1,42

Síntesis de Cefalexina en Reactor Bifásico y Homogéneo Comparación Concentración de Reactivos: 50 mM 6APA, 50mM FGM. Ester Condiciones de Reacción: pH 6,5; T 15ºC; 3M (NH4)2 SO4 / 25mM Fosfato Reactor Homogéneo Reactor Bifásico Tiempo (h) Rendimiento (%) 10 20 30 40 50 60 6 8 4 2

VENTAJAS SISTEMAS BIFASICOS ACUOSOS No es tóxico La enzima puede actuar en ambas fases El uso de derivados inmovilizados permite elegir la fase en la que la enzima realice su función Se puede manipular cualquiera de las fases: Sales Aditivos Codisolventes

NUEVAS PERSPECTIVAS Modificación química derivados PGA Búsqueda de nuevas enzimas

Comparación del Derivado De PGA de E. Coli y el Derivado Modificado Químicamente NH3+ COO- NH2 - CH2 - CH2 - NH2 EDC NH3+ B.. Síntesis de Cefalexina 10 / 10 A. Síntesis de Ampicilina 10 / 10 10 20 30 40 50 10 20 30 40 50 33 29 27 % Rend. Real % Rend. Real Tasa Tasa 21 D.Patron (1) D.52 (1) D. Patron (1) D. 52 (1) ( 1 ) 25 mM PO43-

SINTESIS DE AMPICILINA ACILASAS DE DIFERENTES MICROORGANISMOS CATALIZADA POR ACILASAS DE DIFERENTES MICROORGANISMOS Escherichia coli Kluyvera citrophila Acetobacter turbidans Bacillus megaterium

SINTESIS ESTEREOESPECIFICA DE AMPICILINA 20 40 60 80 100 58 42 85 E.coli Acetob. 7 Rendimientos, (%) Síntesis con D- fenilglicina pura : D - ampicilina Síntesis con D,L- fenilglicina: D- ampicilina Síntesis con D,L- fenilglicina : L- ampicilina

INHIBICION POR ACIDO FENIL ACETICO 100 12,5 93 20 40 60 80 E.coli Acetob. Velocidade de Reacción, (%) Síntesis en ausencia de Ac. fenilacetico Síntesis en presencia de Ac.fenilacetico

SINTESIS DE AMPICILINA ACILASA DE Acetobacter vs. ACILASA DE E. coli menor velocidad de hidrólisis del antibiótico mucho menor inhibición por fenilacético mucha mayor estereoespecificidad

CONCLUSIONES Adsorción Nucleofilo Tasa s / h1 Tasa s / h2 Derivado Actividad Global Rendimientos Solubilidad Reactantes Estabilidad Catalizador Adsorción Nucleofilo Derivado [Substrato] Medio de Reacción Reactor

CONCLUSIONES Adsorción Nucleofilo Tasa s / h1 Tasa s / h2 Derivado Actividad Global Rendimientos Solubilidad Reactantes Estabilidad Catalizador Adsorción Nucleofilo Derivado [Substrato] Medio de Reacción Reactor

CONCLUSIONES Adsorción Nucleofilo Tasa s / h1 Tasa s / h2 Derivado Actividad Global Rendimientos Solubilidad Reactantes Estabilidad Catalizador Adsorción Nucleofilo Derivado [Substrato] Medio de Reacción Reactor

EFECTOS DEL METANOL EN LA SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA INGENIERIA DE LA REACCION EFECTOS DEL METANOL EN LA SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA

EFECTO DEL METANOL 1,7 3 3,3 >20 1 4 0,6 0 % MeOH 40% MeOH D-MandOMe D-PheglyOMe tasa s / h1 tasa s / h2 1,7 3 3,3 >20 1 4 0,6

POSIBILIDAD DE ENCONTRAR ENZIMA / DERIVADO / CONDICIONES Y REACTOR DONDE “TODOS LOS PARAMETROS” SEAN ADECUADOS PARA UN PROCESO ECONOMICA / ECOLOGICA Y TECNOLOGICAMENTE VIABLE E R - COOMe + NH2 R - CONH - R’ R’’’ - COOMe R’’ - COOH Condiciones cercanas a la estequiometria Concentraciones elevadas de producto Condiciones experimentales suaves Presencia de análogos de substrato que no interfieren

SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA DE ANTIBIOTICOS  - LACTAMICOS Enzima de E. coli soluble.... Rendimientos significativos de muchos antibióticos de interes DISEÑO DEL BIOCATALIZADOR / BIOPROCESO Utilización de penicilina acilasa de distintas fuentes Inmovilización / estabilización Modificación química posterior Diseño del medio reacción ( pH, temperatura, codisolventes, fuerza iónica ) Diferentes concentraciones de substratos ( relación, valores...) Utilización de sistemas bifasicos acuosos DIFERENTES MODOS DE OPTIMIZAR INDIVIDUALMENTE CADA PARAMETRO.... ACTIVIDAD / INHIBICIONES / ADSORCION NUCLEOFILO / TASA SINTESIS HIDROLISIS / HIDROLISIS PRODUCTOS

Exceso Ester Rdtos t s /h2 SINTESIS CINETICAMENTE CONTROLADA CEFALOGLICINA [MeOH] (%) Exceso 7ACA Rdtos t s /h1 Exceso Ester Rdtos t s /h2 89% 63% 10 85% 67% 20 80% 70% 30 70% 74% 40 60% 77% pH 7, 4ºC