ESTANDARIZACIÓN DE UNA METODOLOGÍA PARA LA OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE CÉLULAS MADRE TUMORALES EN EL MODELO MURINO 4T1 Tito A. Sandoval, Claudia P. Urueña, John F. Hernández, Susana Fiorentino Grupo de Inmunobiología y Biología Celular, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia. INTRODUCCIÓN El cáncer de mama es el principal tipo de cáncer que afecta a mujeres en el mundo con una incidencia de 38,9/100000 habitantes (1). La terapia se basa en la intervención quirúrgica del tumor primario y quimioterapia adyuvante [2], sin embargo un porcentaje de pacientes presentan recurrencia de la enfermedad (4), debido en gran parte a la presencia de células madre tumorales (CMT), las cuales participan en la progresión metastásica [2] y presentan resistencia a la quimioterapia (3). Las CMT son capaces de auto-renovarse, generar la diversidad tumoral y expresar marcadores relacionados con transición epitelio-mesenquimal, entre otras (5). La búsqueda de terápias dirigidas contra esta población, se constituye en un factor priordial en el tratamiento del cancer de seno metastásico y los productos naturales podrían ser una fuente importante de medicamentos en este campo. El modelo murino de cáncer de seno metastático 4T1 presenta células con alta tumorigenicidad expresando Sca-1 [6] y con capacidad de formar esferas en condiciones no adherentes (autorenovación), carácterístico de CMT [7] por lo que se constituye en un modelo util en la búsqueda de terápias. El objetivo de este trabajo es estandarizar una metodología para la obtención y caracterización de CMT en un modelo de cáncer de seno murino metastásico (Balb/c - 4T1) las cuales serán utilizadas posteriormente en la evaluación de medicamentos específicos para estas células. METODOLOGIA a) Obtención de células metastásicas 4T1 Ampliación 9-10 días 10-15 días 5-10 días Cultivo en RPMI SFB 10% + 6-Tioguanina Inoculación 1x105 células 4T1 Desarrollo Tumor primario Diseminación Metastasis Obtención de órganos (Pulmón e hígado) Disgregación mecánica b) Cultivo de mamosferas CD44 CD24 SSC Sca-1 Fenotipo 1 2 3 4 5 6 7 Sorting celular Sca-1+ y Sca-1- 5 días 8 Recolección de esferas Cultivo en ultra baja adherencia (DMEM/F12, B27, N2) Conteo del # de esferas/104 células Medición del tamaño en pixeles2 o pixeles totales a) Pulaski, B. A. (2001). Current protocols in immunology: 20.22. 21-20.22 b) Chen, D., et al. (2012). Bioorg Med Chem 20(9): 3031-3037 RESULTADOS Las células 4T1 obtenidas de metástasis a pulmón forman esferas mas grandes que la línea parental La expresión de Sca-1 en células 4T1 CD44+/CD24+ varia después de varios pasajes in vivo A. B. A. B. 4T1 4T1P 4T1H CD44-APC Sca-1(Ly6A/E)-PE CD24-Percp-Cy5.5 4T1 4T1P1 4T1P3 Figura 1. Las células 4T1P generan menos cantidad de esferas pero de mayor tamaño, en comparación con las células 4T1. A. Formación de esferas en baja adherencia de células 4T1, 4T1P (metástasis a pulmón) y 4T1H (metástasis a hígado). B. La línea 4T1 genera un numero mayor de esferas (251,6±61), mientras que las células 4T1P forman esferas mas grandes (5,8x105±2,1x105pixeles).3 experimentos independientes. * p0.05, ** p 0.01 Figura 2. Caracterización fenotípica de células 4T1, 4T1P1 y 4T1P3. Las células 4T1 (línea parental), 4T1P1 (metástasis a pulmón después de un pase in vivo) y 4T1P3 (metástasis a pulmón después de tres pases in vivo), fueron caracterizadas fenotípicamente para la expresión de CD44/CD24/Sca-1. A. Estrategia utilizada para la caracterización del fenotipo. B. Las células 4T1, 4T1P1 y 4T1P3 son CD44+CD24+, mientras que la expresión de Sca-1+ varia entre los diferentes pasajes. CONCLUSIONES Esta metodología ha permitido confirmar las presencia de CMT en el modelo altamente metastásico 4T1. La caracterización fenotípica mostró que 4T1 expresa CD44+ y CD24+ en casi el 95% de la población y que Sca-1 es un marcador de CMT que parece estar relacionado con su capacidad de autorenovación (formación de esferas in vitro), similar a lo sugerido por Kruger et al. en 2006. Nuestros resultados muestran una alta variabilidad en la expresión de Sca-1 después de pasajes in vivo. pero los factores que la influencian no están claros. Algunas observaciones preliminares sugieren que el numero de pasajes in vitro y la confluencia de las células en monocapa podrían influir en la expresión de Sca-1, esta posibilidad deberá ser explorada en futuros experimentos. Las células Sca-1+ tienen capacidad de autorenovación Figura 3. Células 4T1 fueron separadas por sorting en un citómetro de flujo FACSAriaII, según la expresión de Sca-1. Las células separadas fueron cultivadas en placas de baja adherencia y se contó el número de esferas. Las células Sca-1+ generaron aproximadamente 10 veces mas esferas que las Sca-1-, sugiriendo que esta población tiene características de CMT AGRADECIMIENTOS A COLCIENCIAS por el apoyo a la beca doctorados nacionales 2010 y la financiación del proyecto 12011050101103, y a la Vicerrectoría de Investigaciones de la Pontificia Universidad Javeriana REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1, GLOBOCAN 2008 (IARC) Section of Cancer Information (11/9/2013); 2. Mego M, Mani SA, Cristofanilli M (2010) Nat Rev Clin Oncol 7: 693-701; 3. Liu H, Patel MR, Prescher JA, Patsialou A, Qian D, et al. (2010). Proc Natl Acad Sci U S A 107: 18115-18120; 4, Ahmad, A. (2013). ISRN Oncol 2013: 290568; 5, Medema, J. P. (2013). Nat Cell Biol 15(4): 338-344.; 6. Kruger JA, Kaplan CD, Luo Y, Zhou H, Markowitz D, et al. (2006). Blood 108: 3906-3912.; 7. Rappa G, Mercapide J, Anzanello F, Prasmickaite L, Xi Y, et al. (2008) Exp Cell Res 314: 2110-2122.