Highlights de la AACR PHiladelPHia 2015 Javier Gómez Román Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Santander Barcelona, 11 Junio 2015

Tópico número 1

¿Qué es la biopsia líquida? Un procedimiento de análisis molecular Una extracción simple de sangre periférica del paciente Extracción de ácidos nucleicos Identificación de las dianas moleculares deseadas

Primary tumor Blood vessel 1 2 3 ¿Qué detectamos? Biomarcadores susceptibles de ser detectados en sangre Ácidos nucleicos circulantes (cfDNA, miRNA) Proteínas libres o receptores celulares Células tumorales circulantes (CTCs)

Caroline Dive. CRUK Manchester Alain Thierry INSERM Montpellier Facilitar el desarrollo de la medicina de precisión a través de biomarcadores circulantes La sangre es un material fácilmente accesible en comparación con la biopsia Predicción: En 2-5 años: Los tests de sangre estratificarán a los pacientes para la medicina personalizada secuencial Detectarán recidivas tempranas e identificarán mecanismos de resistencia a fármacos Serán lo suficientemente sensibles como para permitir el diagnóstico precoz

Caroline Dive. CRUK Manchester Alain Thierry INSERM Montpellier Están listos para sustituir al gold standard (biopsia) En 2014 Astra-Zeneca obtiene la aprobación para uso de Iressa en pacientes tras determinación en biopsia líquida por método de Qiagen cfDNA: Monitorización miRNA circulante: Reproducibilidad, sensibilidad, estandarización CTCs: Heterogeneidad, Investigación

CTCs vs cfDNA Existe discrepancia entre el número de CTCs y la cantidad de cfDNA en sangre Una célula humana contiene 6 pg de ADN. Hay unos 17 ng de ADN por ml de plasma en pacientes con cáncer avanzado Si las CTCs fueran la fuente primaria de cfDNA debería haber unas 2000/3000 células por ml de plasma En realidad hay menos de 10 CTCs por 7,5ml de sangre 100-10.000 veces más material genómico en cfDNA comparado con el de CTCs El cfDNA se encuentra muy fragmentado

ADN circulante El DNA libre circulante (ccfDNA) fue descubierto en 1948 por Mandel y Metais Diagnóstico prenatal*, enfermedades autoinmunes, sepsis o IAM Hay circunstancias que elevan el contenido de cfDNA como el ejercicio físico, el embarazo y las enfermedades autoinmunes *Cuidado con falsos positivos por análisis de DNA somático de células tumorales en trisomías

Orígenes celulares de cfDNA Células malignas y células no malignas Apoptosis, Necrosis, Eliminación activa, Fagocitosis, Descamación cfDNA derivado de tumor puede suponer 50% de todo el cfDNA (Mol Oncol 2014;8:927)

Formas de DNA libre Nucleosomas, Cuerpos apoptóticos, Unido a membrana DNA, RNA, miRNA Mutaciones y polimorfismos, análisis de microsatélites, metilación, alteraciones en número de copias

Estudio de concordancia. Montpellier 106 pacientes con colorectal metastásico Muestras de tumor y plasma 103 de tumor y 98 de plasma (excluyen 8 de plasma por baja concentración de cfDNA) Analizan 95 en paralelo para mutaciones de exón 2 de KRAS y BRAF

Método IntPlex KRAS Tumor Mut WT Sangre 36 1 3 55 BRAF 5 90 Sensib 92% 90 Sensib 92% Espec 96% Thierry Nat Met 2014

¿Qué información aporta? Las concentraciones de DNA son diferentes en pacientes con carcinoma metastásico que en individuos sanos La concentración de DNA mutado es factor pronóstico al igual que el índice de fragmentación

Existe emergencia de mutaciones en pacientes wt con tratamiento específico Los pacientes refractarios a tratamiento se confirmaban como mutados

Problemas Baja concentración de DNA. Se necesitan volúmenes mayores de sangre (10-20ml) La vida media del AND libre es corta (<1.5 horas) Manipulación y almacenamiento de las muestras crítico Puede existir ADN de células de línea hematopoyética si la sangre no está bien estabilizada (Aumento del “fondo” no tumoral) Pueden existir mutaciones en células de línea germinal que no sean deletéreas. Comparación con células germinales en el caso de secuenciación de exoma Estandarización en los métodos de extracción DNA muy fragmentado

Diana Seq IntPlex Single locus Beamng TAmSeq NGS WGS Bases examinadas 1-10 104 103-108 108 Sens <0,01% <0,1% 0,2% 1% 10% Coste $ 100 500 1000 3000 Tiempo 2 días 6-10 días 2 semanas 1 mes 2 meses

Hospital Vall d’Hebron Líquido cefalorraquideo en tumores cerebrales primarios y metastásicos El DNA circulante en LCR es más abundante que en plasma en el caso de tumores de SNC Se puede caracterizar el DNA libre en LCR mediante NGS permitiendo análisis complejos La concentración fluctua en respuesta a cambios en el ambiente tumoral. Permite la monitorización en carcinomatosis meníngea

Tópico número 2 ¿Por qué NGS? Para navegar por la tormenta perfecta de la genómica del cáncer, el diagnóstico y la terapia de precisión

Clinical cancer genomics for personalized medicine Marc Ladanyi

Panel clínico del MSKCC en Adenocarcinoma de pulmón Panel de 91 mutaciones en 8 genes EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, ERBB2, PI3K, MEK1, AkT Seis multiplexed cada una con 10 ng (total 60 ng) Análisis multiplex de tamaños para deleciones e inserciones en exón 19 y 20 de EGFR y exón 20 de ERBB2 FISH para ALK FISH para RET/ROS1

Panel clínico del MSKCC en Adenocarcinoma de pulmón El adenocarcinoma de pulmón es el ejemplo perfecto de porqué necesitamos plataformas multimarcador Escasez de material Necesidad de múltiples técnicas Problemas para conseguir material tisular

Fragmentos enriquecidos PCR Genoma 3 GB Fragmentos enriquecidos <1% del genoma Captura de híbridos Next Gen Seq Mutaciones Indels Fusiones Ganancias Pérdidas *Sólo con captura de híbridos

MSK-IMPACT Cheng D et al. MSK-Impact. A Hybridization capture-based next-generation sequencing clinical assay for solid tumor molecular oncology. Journal of Molecular Diagnostics.2015 May;17(3):251-64. Michael Berger

MSK- IMPACT Detección de alteraciones tratables en pacientes con cáncer avanzado candidatos para terapia de precisión en ensayos clínicos Secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina Consentimiento informado

MSK- IMPACT Tiempo necesario para el análisis 2-3 semanas De manera óptima se requiere tejido normal pareado con el tumoral para evitar considerar SNPs como mutaciones patogénicas La extracción de ADN a partir de tejido parafinado Más del 10% de células tumorales 100 ng de ADN Fuente de ADN normal Sangre (5-10 ml tubo malva) Bloque con tejido normal

MSK-IMPACT Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets Aplicaciones clínicas Selección de terapias personalizadas basadas en perfil molecular Seleccionar pacientes para ensayos clínicos Clarificar diagnóstico y pronóstico Aplicaciones de investigación Descubrimiento de genes driver en tipos tumorales poco frecuentes Identificar nuevos biomarcadores Definir marcadores de progresión, resistencia a fármacos Definir los efectos de mutaciones concurrentes

MSK-IMPACT Comité de selección de genes Panel de 341 genes (exones) Anatomía Patológica, Oncología médica y radioterápica, Biología computacional Panel de 341 genes (exones) 33 intrones de 14 genes susceptibles de reordenamiento (ALK, BRAF, EGFR, ETV6, EWSR1, RET, ROS1, TMPRSS2, NTRK1, PAX8, FGFR2, FGFR3, NUT, BCL2L11 Promotor del gen de la telomerasa (TERT) Múltiples controles Sensibilidad 2% para hotspot

MSK-IMPACT Genes importantes desde el punto de vista asistencial AKT1, ALK, BRAF, EGFR, ERBB2, FGFR2, FGFR3, GNA11, GNAQ, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, KIT, KRAS, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, TP53

MSK-IMPACT 125 casos / semana

Algunos datos… Media de mutaciones por caso: 6 (mediana 3) El gen mutado más frecuentemente TP53 Nuevo enfoque para detección de amplificaciones génicas (coamplificaciones) Detección de nuevas mutaciones driver

Comparación con TCGA atlas MSK - IMPACT TCGA Tumores recidivantes o metastásicos, frecuentemente tratados Tumores no tratados Tejido fijado en formol e incluido en parafina (celularidad 10-20%) Tejido de alta calidad congelado con celularidad >50% Secuenciación con profundidad de lectura >500x Secuenciación standar de exoma a 100-200x Mejor detección de mutaciones subclonales Mayor espectro de datos Mejor detección de alteraciones en número de copias y reordenamientos estructurales Datos limitados Material limitado para otros estudios

http://www.cbioportal.org/index.do

Ensayos clínicos Basket Independientes de la histología Alteraciones genómicas como base de clasificación Terapia uniforme (única o en combinación) Múltiples cohortes específicas de enfermedad. Análisis estadístico independiente Screening molecular centralizado prospectivo poco común No randomiza

Conclusiones La genómica de gran escala es posible con un tiempo de respuesta clínico práctico Los paneles grandes permiten la inclusión de nuevos genes Colección de muestras de sangre con consentimiento informado para estudio de líneas germinales Gran inversión inicial en infraestructura y personal Puede llegar a ser coste-efectiva

Tópico número 3 Heterogeneidad tumoral “Una biopsia es como tratar de comprender cómo funciona una vaca estudiando una hamburguesa” A. Aktypis

Preguntas ¿Qué es un clon? Un grupo de células genéticamente idénticas (probablemente cada célula es única) Un grupo de células que comparte una alteración genética distintiva a partir de un ancestro común Los estudios de divergencia proporcionan datos respecto al tiempo de separación de ese ancestro común. Requieren un reloj molecular

El 86% de los tumores tiene más de un clon con >10% de celularidad

Carlo Maley. San Francisco Tumor heterogeneity and evolution Concepto de divergencia como evolutivo asociado a un reloj biológico relacionado con la distancia al ancestro común. Se analiza mediante LOH o microsatélites en diferentes loci. La heterogeneidad es debida a dos factores, Jerárquicos y Genéticos Es decir, existen células stem, y tumorales con diferentes programas y jerarquí Existe una evolución clonal que provoca diferentes mutaciones en diferentes células. La combinación de estos fenómenos hace que todo tipo de célula jerárquica pueda tener cualquier tipo de mutación.

Carlo Maley. San Francisco El microambiente tumoral (acidosis, hipoxia, contacto directo con fibroblastos) provoca cambios en el fenotipo. Las situaciones de stress pueden originar una canalización de determinados fenotipos o acabar extinguiéndolos El carcinoma renal es mucho más heterogéneo que el colorrectal o el gástrico Mutaciones de resistencia presentes desde el inicio