Proteasas de Helmintos Parásitos- El caso de Fasciola hepatica

Fasciola hepatica Causa la Fasciolosis Afecta rumiantes Zoonosis emergente, varios millones infectados en Bolivia y Perú Produce pérdidas multimillonarias a nivel global

Ciclo biológico de Fasciola hepatica

Problemas en el control de la Fasciolosis Drogas efectivas pero costosas Animales se reinfectan con facilidad Tratamiento no evita el daño hepático Focos de resistencia en Europa

Selección de los productos de excreción/ secreción (E/S) como objeto de estudio Se pueden obtener en forma relativamente sencilla en cantidades aceptables a partir de gusanos adultos La fasciola tiene intestino ciego por tanto regurgita el contenido. Sus componentes entran en contacto con el medio interno del huésped. Tienen composición menos compleja que el homogeneizado somático

ACTIVIDAD GELATINOLITICA DE LOS PRODUCTOS DE E/S DE FASCIOLA HEPATICA CL1 gelatinolytic activity CL2 29 kDa CL1 27,5 kDa CL2 gelatinolytic activity

Catepsinas L de Fasciola Son el 80% de los productos de E/S Producidas y secretadas por células del tubo digestivo CL1 de 27,5 kDa es mayoritaria CL2 de 29 kDa Se diferencian por actividad sobre péptidos fluorogenicos sintéticos

Actividades de CL1 y CL2 de Fasciola hepatica sobre peptidos fluorogénicos acoplados a AMC Kcat/Km M-1.s-1

Actividades in vitro de los PES de Fasciola hepatica sobre IgG1 humana Digestion of IgG1 by Fasciola hepatica E/S products and immunological characterization of the main released products. IgG1l (100 mg) was incubated for 22 h with F. hepatica E/S products(10 mg) at pH 7.3 and 37 C. Proteins were run on 12.5% SDS–PAGEunder nonreducing (left) and reducing conditions (right) and stained with CBB R-250 (lanes 1 through 4) or electrotransferred to nitrocelluelectrotransferred to identify the main digestion products by Western blotting using specific antisera (lanes a through h): Lanes 1 and 4, IgG1l undigested control; lanes 2 and 3, IgG1l 1 E/S products; lanes a and e, anti-L chain; lanes b and f, anti-Fd; lanes c and g, anti-Fcg, lanes d and h, anti-g1 H chain.

Actividades in vitro de las Catepsinas L de Fasciola hepatica sobre IgGs humanas Sitios de corte

Catepsinas L de Fasciola hepatica: Sitios de clivaje de IgGs humanas

Actividades de PES y Catepsinas L de Fasciola hepatica sobre inmunoglobulinas humanas de clase IgG Conclusiones CL1 y CL2 son las principales responsables de la degradación de las subclases de IgG con PES a pH 7.2 a manera de la papaína produciendo los fragmentos Fab y Fc A pH 5.5 los PES producen la degradación adicional a fragmentos pequeños derivados de la porción Fc Sólo IgG3 es clivada en ausencia de DTT Los sitios de corte determinados para CL1 y CL2 no se corresponden con los aa P1 y P2 de los sustratos sintéticos utilizados para determinar la actividad catepsina L (Phe-Arg )

Matriz extracelular y membranas basales

Actividad colagenolítica sobre colágeno fibrilar tipo I

Acividades sobre Fibronectina

Degradación de Laminina

Catepsinas L de Fasciola: Actividad proteolitica sobre componentes de la matriz extraceular y las membranas basales Conclusiones Colágeno I: es degradado por los PES y en menor medida por CL1 y CL2 en presencia de Cys. Colageno III: es clivado tanto por PES como por las CLs. Colágeno IV: degradado completamente por los PES sin Cys, y por CL1 y CL2 en presencia de Cys. Elastina: No se observa actividad proteolitica. Laminina: Es cortada por PES, CL1 y CL2. Fibronectina: Es atacada por PES, CL1 y CL2 produciendo patrones de corte diferentes.

Actividad fibrinogenolítica de CL2: Formación del coágulo

Inhibición de las Catepsinas L de Fasciola hepatica por anticuerpos de conejos infectados Conejos infectados con 30MT c/u y sangrados hasta s20 IgGs purificadas por afinidad Incubación IgGs con CLs, 20min, relación 10:1

Inhibición de las Catepsinas L de Fasciola hepatica por anticuerpos de conejos infectados y tratados La actividad gelatinolítica de ambas catepsinas desaparece a las 4-5 semanas postinfección y reaparece 2-4 semanas después del tratamiento con triclabendazol

ENSAYO DE VACUNACION Groups: CatL1 CatL2 Control Wk 0 4 6 20 Inmumization Booster Challenge Necropsy (100 ug antígen in CFA) (100 ug antígeno in IFA) (300 metacercariae)

ELISA ANALYSIS OF IgG RESPONSES AGAINST ELISA ANALYSIS OF IgG RESPONSES AGAINST CL1 AND CL2 IN SHEEP FROM TRIAL 1 CL2 CL1 A.U. A.U 300 600 250 500 200 400 150 300 100 200 50 100 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Semanas Semanas CONTROL CL1 CL2

Worm burdens and FEC in sheep vaccinated against F Worm burdens and FEC in sheep vaccinated against F. hepatica with CL1 and CL2 in Trial 1 Group Eggs/g Egg output reducción Flukes % worm Feces (%) recovered reduction CL1 41,8+/-41,2 71 109,1+/-24,6 34 CL2 28,0+/-38 81 107+/-40,1 33 Control 141,8+/-75,6 100 161,4+/-21,4 100

OTRAS PROTEASAS DE FASCIOLA HEPATICA DIPEPTIDIL PEPTIDASA (DPP) LEUCIN AMINOPEPTIDASA (LAP) CATEPSINA B LEGUMAINA

DIPEPTIDIL PEPTIDASA (DPP) Actividad presente en PES de adultos Clivaje preferncial de Gly-Pro y Lys-Ala Novel con relación a las DPPs de mamíferos Aún sin caracterización molecular

LAP de Fasciola hepatica Metaloproteasa Zn++ dependiente purificada de extracto soluble en deoxicolato Holoenzima hexamérica formada por subunidades de 67 kDa Asociada a tubo digestivo Purificada por columna de afinidad con su inhibidor Bestatina Trazas en los PES

TRIAL DESIGN Groups: CL1+CL2 LAP CL1+CL2+LAP Control Wk 0 4 6 20 Inmumization Booster Challenge Necropsy (100 ug antígen in CFA) (100 ug antígeno in IFA) (300 metacercariae)

WESTERN BLOT ANALYSIS OF IgG RESPONSE AGAINST F WESTERN BLOT ANALYSIS OF IgG RESPONSE AGAINST F. HEPATICA PROTEINASES IN SHEEP DURING THE COURSE OF VACCINATION TRIAL Groups: Weeks: Control CL1+CL2 LAP CL1+CL2+LAP LAP CL2 CL1 P L P L P L P L P L P L P L P L P L P L P L 0 12 0 6 12 0 6 12 0 6 12 P =E/S products L =Leucine aminopeptidase

IgG ANTI-LAP RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2 7000 A.U. 6000 5000 CONTROL 4000 LAP CL1-CL2 3000 CL1-CL2-LAP 2000 1000 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Weeks

IgG ANTI-CL2 RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2 50 100 150 200 250 300 350 400 450 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Weeks A.U. CONTROL LAP CL1-CL2 CL1-CL2-LAP

IgG ANTI-CL2 RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2 A.U. 100 200 300 400 500 600 700 800 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Weeks CONTROL LAP CL1-CL2 CL1-CL2-LAP

Worm burdens recovered in sheep vaccinated against F Worm burdens recovered in sheep vaccinated against F. hepatica with CL1, CL2 and LAP in Trial 2 GROUP: CL1-CL2 GROUP: CONTROL Animal No. Flukes recovered Animal No. Flukes recovered 104 56 101 126 110 89 119 59 114 0 122 54 121 0 134 56 125 5 139 65 128 1 Mean 72 135 0 136 0 137 57 Mean 23,1

Worm burdens recovered in sheep vaccinated against F Worm burdens recovered in sheep vaccinated against F. hepatica with CL1, CL2 and LAP in Trial 2 GROUP: LAP GROUP: CL1-CL2-LAP Animal No Flukes recovered Animal No Flukes recovered 106 0 102 43 107 1 116 0 113 38 120 0 123 0 124 0 130 0 127 30 132 0 138 0 Mean 6,5 Mean 12,1

Reduction in F. hepatica worm burdens obtained in Trial 2 with CL1, CL2 and LAP Group Reduction (%) LAP 89,6 CL1-CL2 60,1 CL1-CL2-LAP 79,3

OVERVIEW OF VACCINATION TRIALS CONDUCTED IN SHEEP Antigen Protection Egg Output Reduction ProCL1r Not Significant ND CL1 32% 71% CL2 34% 81% Paramyosin 57% 85% CL1-CL2 60% 82% CL1-CL2-LAP 79% LAP 90% 91%

Ensayos in vitro muestran una correlación positiva entre la capacidad de inhibición de la actividad enzimática por parte de los anticuerpos LAP específicos y los niveles de protección alcanzados

Construcción del producto LAP completo 5´RACE 3´RACE M 3´ 5´ 5 Ciclos Generación de FL 2Kb 1,3 kb PCR 20 Ciclos Amplificación de FL

FhLAP is a member of the M17 family of metalloproteases (MEROPS) Neighbor joining unrooted tree of the conserved C-terminal domain of LAPs Acosta et al, 2008

Purificación 500 ml de cultivo Columna quelante Hi Trap (Ni) Binding: 50 mM Tris 01 M NaCl pH 8.3 Elución: 50 mM Imidazol 1 Muestra 2 No retenido 3 Control 4, 5, 6 Eluidos 7 s/ inducir 8 inducido

Purification of FhLAPr using ProBond™ resin Acosta et al, 2008

MODELADO MOLECULAR DE FhLAP

Catabolismo de la hemoglobina GLOBULOS ROJOS HEMOLISIS saposina Hb esófago ENDOPEPTIDASAS ej: catepsina L1-2 catepsina B catepsina D POLIPEPTIDOS gastrodermis lúmen del ciego   LEGUMAINA EXOPROTEASAS ej: catepsina C, DPP Aminopeptidasa?   DIPÉPTIDOS gastrodermis AA? lúmen del ciego

Reactividad cruzada entre FhLAPn y FhLAPr Inmunoblot Suero de oveja inmunizada con FhLAPn Suero de conejo inmunizado con FhLAPr SDS PAGE 12,5% condiciones reducidas

FhLAP is localized in gastrodermal cells by IEM Negative Control

Maldi-Tof de FhLAPn 14 péptidos 192 residuos reconocidos en 523 36,7% de cobertura >FheLAPr MAALAVGVSDLSDKRFDVVIFINDDADEGCAKDAAVYEALKSFSKINPNLGSELSIVPFPAHPSGRLIYSPTGALNTDTADIRNVYDAACAGVKRALSMGCHAPLLYLGSLRSASFGFEWMQRKHLLLNALLGAYHALYLPLEVREMRPTTGLKAQHLGVKEDTKGSDELVLRLAMALEEGRWLARDIGGSDPERMAAPRIVDYLKTSLGGMKGITMSVEKVDIQKYPLMAAVNRAASVVARHDGRVVHLKYEPPNPTEVDTTLYLIGKGITYDTGGADIKANGVMAGMHRDKCGAAAIAGLFKTLGELQPPGLSVSAALAFVRNSVGADSYVADEILVARSGQRIRVGNTDAEGRMVMTDLLCEAKEKAINATNPFLFTIATLTGHVVRAYKHYTAVMDNGPPRIHRVSQSLQEAGDRISDMAEISTVRKEDYEFNRGKTEYEDTLQCNNLPSSATPRGHQIPAAFMALASGLDKHGLGSAKPIPYTHVDVAGSATEIHVLPTAAPLLMFASRYVLPRLGFK

Actividad frente a distintos aminoácidos nmol/min.mg Sustrato FhLAPr FhLAPn Leu-AMC 214.5 ± 5.5 134.4± 0.5 Arg-AMC 29.1 ± 0.8 75.2 ± 0.0 Ala-AMC 7.5 ± 0.1 8.32 ± 0.0 Phe-AMC 6.8 ± 0.2 14.08 ± 0.0 Tyr-AMC 6.4 ± 0.5 5.44 ± 0.0 Pro-AMC 5.6 ± 0.1 3.2 ± 0.2 Ser-AMC 2.1 ± 0.1 1.92 ± 0.0 Gly-AMC 1.9 ± 0.1 0.544 ± 0.0 Glu-AMC 0.12 ± 0.1 0.224 ± 0.0

Respuesta humoral de ovinos (ELISA) 0 4 6 10 15 20 25 4 Priming Recuerdo Desafio

Recuperación de parásitos en ensayo de inmunización en conejos Grupo N° de parásitos recuperados Promedio ± DS Parásitos/animal Grupo FhLAPr (n=6) 2 ± 1.67 4; 0; 3; 3; 2; 0 Control (n=6) 9 ± 1.78 10; 12; 8; 8; 7; 9 Recuperación Grupo Control = 18% Grupo Inmunizado = 4% Porcentaje de Protección (Control – Inmunizado) x 100 Control 78%

Vaccine trial using FhLAPr mixed with different adjuvants GROUPS FCA + FIA n = 10 Adyuvac 50 n = 10 Alum n = 10 Ribi n = 10 DEAE-Dextran n = 10 Control (FCA + FIA) n = 10 Wk 0 4 6 18 Inmumization Booster Challenge Necropsy 100 ug Ag 100 ug Ag 200 metacercariae Maggioli et al, 2011

Mean ± SD recovered worms Size of recovered worms (mm) Parasitological findings in adjuvant trial Groups Recovered worms Mean ± SD recovered worms Recovery % Protection % Egg viability % Size of recovered worms (mm) Lenght Width Control 94, 30, 46, 73, 76, 114, 34, 93, 85, 31 67.6 ± 30.3 33.8 ______ 36.1 19.4 ± 2.5 8.9 ± 1.3 FCA + FIA 5, 3, 13, 11, 4, 16, 10, 21, 24, 3 11.0 ± 7.5 5.5 83.8* 27.5 19.5 ± 3.5 8.0 ± 1.6 Adyuvac 50 20, 19, 16, 49, 17, 24, 9, 3, 13, 3 17.3 ± 13.1 8.5 74.4* 20.3* 18.2 ± 2.6 8.7 ± 1.4 Alum 14, 4, 2, 1, 8, 1, 20, 0, 14, 25 8.9± 8.8 4.4 86.9* 9.6* 19.1 ± 3.9 7.9 ± 1.6 DEAE-D 95, 34, 8, 18, 38, 42, 30, 26, 30, 21 34.2 ± 24.6 17.1 49.5* 18.3* 18.6 ± 2.1 9.0 ± 1.2 Ribi 26, 23, 18, 44, 20, 56, 41, 10, 77, 25 34.0 ± 20.5 17.0 49.8* 54.1* 19.0 ± 2.7 9.3 ± 1.3 Maggioli et al, 2011

Total IgG response against FhLAPr in vaccinated groups DEAE-D FCA/FIA Adyuvac 50 Alum RIBI Control Maggioli et al, 2011

Correlation between IgG titres at the time of the challenge and worm recovery Sample size 60 Correlation coefficient r -0,2820 Significance level P=0,0336 95% Confidence interval for r -0,5054 to -0,02309 Maggioli et al, 2011

IgG1 response against FhLAPr in vaccinated groups at different time points

IgG2 response against FhLAPr in vaccinated groups at different time points

Anti FhLAPr IgG1/IgG2 ratio in vaccinated groups at different time points

Vaccine trial using FhLAPr mixed with Adyuvac 50 1 vs 2 boosters GROUPS Adyuvac 50 control 1x n = 6 LAP 1x n = 6 Adyuvac 50 control 2x n = 6 LAP 2x n = 6 Wk 0 4 6 18 Priming Booster Infection Necropsy 100 ug 100 ug 200 mets Wk 0 4 8 10 20 Priming Booster Booster Infection Necropsy 100 ug 100 ug 100 ug 200 mets

Size of recovered worms (mm) Parasitological findings in Adyuvac 50 trial Groups Recovered worms Mean recovered worms Recovery % Protection % Size of recovered worms (mm) Lenght Width Control x1 36, 105, 53, 11, 55, 38 49.5 24.7 ______ 20.2 ± 3.7 9.4 ± 1.9 rFhLAP x1 6, 10, 11, 36, 7, 3 12.3 6,1 75.2* 18.7 ± 2.9 8.4 ± 1.1 Control x2 54, 35, 61, 56, 59, 54 53.1 26.5 19.3 ± 3.2 8.0 ± 1.0 rFhLAP x2 28, 13, 42, 44, 90, 27 40.8 20.4 26.2 18.6 ± 2.5 8.7 ± 1.2