Conceptos generales, métodos y estrategias en la clonación de

Presentación del tema: "Conceptos generales, métodos y estrategias en la clonación de"— Transcripción de la presentación:

1 Conceptos generales, métodos y estrategias en la clonación de
fragmentos de DNA Carlos Ríos Velázquez, PhD Departamento de Biología UPR-Mayagüez ext. 2874; C-323

2 Clonando fragmentos de DNA

3 Clonando fragmentos de DNA
Obteniendo el material genético genómico vectores Enzimas de restricción tipos consideraciones especiales Clonaje la reacción parámetros Detección transformación otras maneras de detección

4 Monitoreo de transformantes
Obteniendo el material genético Muestra ambiental Aislamiento de DNA Clonaje en BAC Transformación en organismo vector Monitoreo de transformantes Extracción directa

5 Aislamiento de comunidad Amplificación de 16S/18S rDNA
Obteniendo el material genético Muestra ambiental Aislamiento de comunidad microbiana Aislamiento de DNA Amplificación de 16S/18S rDNA Clonaje en vector Extracción celular

6 Obteniendo el material genético
Químico/enzimático Lisis alcalina Detergentes agentes caotrópicos lisozima proteinasa K Mecánico “bead beating” sonicación “freeze and thaw”

7 Obteniendo el material genético
DNA genómico A B

8 Equipo separación DNA genómico de
alto peso

9 Equipo separación DNA genómico de
alto peso

10 Vectores recombinantes: plásmidos
Plásmidos: aspectos generales DNA extracromosomal Propio origen de replicación Circulares Número de copias variable

11 Vectores recombinantes: plásmidos
Gen de selección pUC 18 MCS Gen reportero

12 Vectores recombinantes
pBeloBac11 BAC (Bacterial Artificial Chromosome) distintos vectores han sido diseñados para clonar fragmentos grandes de DNA.

13 Vectores recombinantes
pBeloBac11 Gen reportero, para realizar alfa-complementación.

14 Vectores recombinantes
pBeloBac11 Región con sitios de restricción únicos para el clonaje de fragmentos.

15 Vectores recombinantes
pBeloBac11 Genes para partición, selección, regiones para amplificación específica.

16 Vectores recombinantes
pBeloBac11 Genes para partición, selección, regiones para amplificación específica.

17 Vectores recombinantes
pBeloBac11 Genes para partición, selección, regiones para amplificación específica.

18 Vectores recombinantes

19 Clonando fragmentos de DNA

20 Sistemas de restricción y modificación
Enzimas de restricción Cortan el DNA en secuencias específicas (target or recognition sequences) Enzimas de modificación (metiltransferasas) Sma I : Serratia marcescens

21 Sistemas de restricción y modificación
Funciones biológicas: Repara daños por agentes externos o errores en replicación. Brinda protección al genoma de la bacteria de ser cortado por sus propias enzimas de restricción. Brinda protección contra DNA exógeno y virus.

22 Sistemas de restricción y modificación
Tipo II Son utilizadas en ingeniería genética y reconocen una gran variedad de secuencias La enzima es solo responsable de realizar el corte, mientras la metilación es realizada por lo otra enzima en la célula. La secuencia de reconocimiento se caracteriza por ser un palíndrome de alrededor de 4-6 bp.

23 Enzimas de restricción
EcoR I 5´ ... G A A T T C ... 3´ 3´ ... C T T A A G ... 5´ 3’ 5’ 5’ 3’ Pst I 5´ ... C T G C A G... 3´ 3´ ... G A C G T C... 5 3’ 5’ 5’ 3’ Sma I 5´ ...C C C G G G... 3´ 3´ ...G G G C C C... 5´ 5’ 3’ 3’ 5’

24 Enzimas de restricción
Consideraciones especiales: Presencia de sitios deseados Número de enzimas Metilación Temperatura

25 Clonación: componentes
Vector Fragmento de DNA Amortiguador Enzima plásmido genómico pH, sales, ATP Ligasa de DNA de T4, topoisomerasas.

26 Clonación: parámetros
Razón de inserto a vector [3:1] visual vs espectrofotometría Dejar en hielo por 30 minutos unión por complementación Incubar a 15oC o/n

27 Clonación: situaciones
Ausencia de sitios de restricción deseados. Necesidad de direccionalidad. Dificultad “blunt” vs “sticky”. Tamaño del fragmento a clonar. otros detallitos…. (metilación)

28 +(3) + + Clonación: la reacción Un experimento sin controles no es….
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Effic. +(3) Inserto nada nada nada cortado defosfa. Cortado defosfa. Cortado defosfa.(1) Sin cortar vector + + nada nada ligasa 0…? 0…? 0…? >106 t/ug DNA Bacteria en medio con: (a) antibiótico (b) X-gal

29 Clonación www.bio.davidson.edu/.../spring99/ bill/ligation.JPG

30 Clonando fragmentos de DNA

31 Expresión, detección y monitoreo de transformantes
Transformación. Transfección. Electroporación.

32 Expresión, detección y monitoreo de transformantes
Colony PCR

33 “white blue screen” X-GAL X + GAL (incoloro) (color)

34 GFP o genes lux E. coli E. coli-GFP no-fluorescencia fluorescente

35 GFP o genes lux E. coli E. coli-GFP no-fluorescencia fluorescente

36 GFP o genes lux 3 4 1 5 2 E. coli E. coli-GFP
no-fluorescencia fluorescente

37 GFP o genes lux 3 3 5 4 4 1 5 2 2 1 E. coli E. coli-GFP
no-fluorescencia fluorescente

38 GFP o genes lux

39 ¿PREGUNTAS? Tarzan X