Aislamiento de Acidos Nucleicos II: DNA Exógeno (Plásmido) JA Cardé, PhD Biol 4019 - Lab Biología Celular Molecular Universidad de Puerto Rico, Aguadilla

Objetivos Explicar diferentes métodos de aislamiento de ácidos nucleicos. Contrastar las ventajas y desventajas de los diferentes métodos de aislamiento de ácidos nucleicos. Describir las funciones de las diferentes soluciones utilizada en las técnicas de aislamiento de ácidos nucleicos. Realizar una extracción de DNA de plasmido por columna de centrifugación

Introducción Molécula muy resistente: estable El DNA aislado puede ser genómico o extracromosomal (figura 1). El DNA genómico es de gran tamaño El DNA extracromosomal es aislado de bacterias en forma de fagos o plásmidos. En este módulo estudiaremos las técnicas de aislamiento de DNA genómico.  La mayor preocupación es la contaminación (otro DNA, RNA o proteínas) como se espera de la macromolécula que transfiere la información genética de generación en generación de reactivos y de las muestras con DNA extraño.    El DNA genómico es de gran tamaño y debe ser manipulado con cautela para evitar romperlo.

DNA Genómico vs Extracromosomal Tamaño Estabilidad Métodos de aislamiento Lisis Aislamiento Purificación

Plásmidos Pequeño círculo de DNA bacterial Indpendiente del cromosoma Contiene genes que confieren fenotipos Pueden ser transmitidos de una bacteria a otra Usados en ingeniería genética

Plásmidos Donde ? Naturalmente en bacteria y levaduras Ingeniería genética DNA Recombinante Clonación GMO

Plásmidos – Características Ori Selección Resistencia MCS.

Plásmidos - Historia 1903 – Sutton y Boveri sugieren la presencia de unidades hereditarias en los cromosomas 1910 – 1950 – Otros los apoyan Expanden estudios sobre el “apareo” de E. coli Defienden el concepto de cruces e intercambio de cromosomas 1952 – Lederberg sugiere el término plásmido 1962 – Se aisla DNA circular (forma de plásmido) Aplicaciones modernas: clonación (replicación), GMO, DNA recombinante

Plásmidos - Tipos Tipos R – portadores de resistencia a antibioticos Tipos Col – producen bacteriocinas Tipos F – requieren sistema de fertilidad Episomas – ayudan a su integración en el cromosoma, aumenta eficiencia de transferencia Virulencia – producen toxinas que dañan a los hospederos

Plásmidos - Tipos Tipos R – portadores de resistencia a antibioticos Tipos Col – producen bacteriocinas Tipos F – requieren sistema de fertilidad Episomas – ayudan a su integración en el cromosoma, aumenta eficiencia de transferencia Virulencia – producen toxinas que dañan a los hospederos

Plásmidos - Tipos Tipos R – portadores de resistencia a antibioticos Tipos Col – producen bacteriocinas Tipos F – requieren sistema de fertilidad Episomas – ayudan a su integración en el cromosoma, aumenta eficiencia de transferencia Virulencia – producen toxinas que dañan a los hospederos

Pasos para aislar plásmidos: 1. lísis celular Rompe la pared y membrana celular Permite que el plásmido (por su tamaño) salga de la célula Se usa un amortiguador de lisis (LB) SDS –(Sodium Dodecyl Sulfate), detergente solubiliza los fosfolípidos y proteínas de la membrana celular permite que se liberen componentes celulares Rnasa A degrada el RNA de hebra sencilla. Rompe enlace fosfodiéster entre 5’-ribosa de un nucleótido y el grupo fosfato del 3’-ribosa de un nucleótido de pirimidina adyacente. El resultante 2’, 3’-fosfato cíclico es hidrolizado a su 3’-nucleósido fosfatado correspondiente. Si se aisla RNA con plásmido, como ambos tienen nucleótidos en común, se contamina la muestra.

Pasos para aislar plásmidos: 1. lísis celular NaOH – denaturaliza las proteínas, el DNA cromosomal y el DNA plásmido Tiempo de incubación con LB debe ser específico para permitir liberación del plásmido sin que salga el DNA genómico Mucho tiempo de incubación en condiciones alcalinas puede causar desnaturalización irreversible del plásmido Se añade RNasa A y se utiliza material libre de DNasa - ¿por qué? Rnasa A degrada el RNA de hebra sencilla. Rompe enlace fosfodiéster entre 5’-ribosa de un nucleótido y el grupo fosfato del 3’-ribosa de un nucleótido de pirimidina adyacente. El resultante 2’, 3’-fosfato cíclico es hidrolizado a su 3’-nucleósido fosfatado correspondiente. Si se aisla RNA con plásmido, como ambos tienen nucleótidos en común, se contamina la muestra.

2. Precipitación proteínas y DNA genómico Amortiguador de precipitación Acetato de potasio (ácido) Neutraliza la lisis La adición de acetato de potasio a LB forma KDS (Potassium Dodecyl Sulfate) y sales LB contiene NaOH, al añadir acetato de potasio que es ácido, se neutralizan se ionizan y forman sal y agua.

2. Precipitación proteínas y DNA genómico Las sales causan la precipitación de: KDS las proteínas desnaturalizadas el DNA cromosomal (genómico) componentes celulares Todos atrapados en los complejos de sal y detergente Como el plásmido es pequeño y cerrado (unido por enlaces covalentes) recupera su forma original y se mantiene en solución. Tamaño y conformacion del plasmido evita que se denaturalice irreversiblemente

3. Separación del plásmido de los componentes celulares Se mezcla bien la solución para precipitar todo el SDS residual El detergente reduce la interacción entre la resina de la columna de cromatografía y el DNA El plásmido en solución se pasa por una columna de cromatografía que lo atrapa La resina de la columna tiene moléculas que se unen al DNA mediante cargas eléctricas (intercambio de aniones)

3. Separación del plásmido de los componentes celulares El plásmido en solución se pasa por una columna de cromatografía que lo atrapa La resina de la columna tiene moléculas que se unen al DNA mediante cargas eléctricas (intercambio de aniones) DNA, carga negativa y la columna, carga positiva Las sales y el pH de la solución facilitan la unión entre DNA-columna Cualquier otra molécula que quede en la solución, pasará por la columna sin adherirse a ella. Intercambio Ionico Anionico Cationico

4. Elución del plásmido Para asegurar que sólo el plásmido está unido a la columna, se usa un amortiguador de lavado (wash buffer) WB tiene concentración de sal (825mM NaCl) que facilita unión DNA-columna y permite que otras moléculas no se adhieran a la columna.

4. Elución del plásmido Elución del plásmido con elution buffer Alta [NaCl] (1.25M NaCl) rompe enlaces iónicos entre DNA-columna (intercambio) Precipitación del plásmido Alcohol precipita DNA Centrifugación separa las sales del DNA precipitado El pellet de DNA se resuspende en amortiguador Tris-HCl y EDTA

Procedimiento G. M. Varela Agront, PhD, MPH

Materiales Kit PureLink Quick Plasmid Miniprep Cultivo de bacteria Invitrogen K2100-10 Hasta 30 ug 30-45 min Pureza para próximas aplicaciones Cultivo de bacteria Micropipetas Microcentrífuga Etanol Hielo

Protocolo- Extracción DNA Plasmido Purificación de Plásmido por Centrifugación Invitrogen Purelink Quick Plasmid Miniprep Kit Etanol al wash buffer Añadir RNAsa al resuspensión buffer Precalentar el TE   Centrifugar 1-5 ml de cultivo de ON en LB por 5-10 min 4000 rpm 2. Resuspender bien en RB (nevera) 250ul y transferir a microtubo. (homogéneo) 3. Lisar con 250 ul de lysis buffer (L7) – NO vortex… mezclar Invirtiendo, incubar 5 min RT.

Protocolo- Extracción DNA Plasmido Purificación de Plásmido por Centrifugación Invitrogen Purelink Quick Plasmid Miniprep Kit   4. Precipitar con 350ul de PB – NO vortex, mezclar Invirtiendo, centrifugar 12Krpm por 10 min. 5. Añadir el sobrenadante a columna montada sobre tubo recolector, centrifugar 12Krpm por 1 minuto, descartar el filtrado. (DNA unido a la matriz) 6. Lavado y remoción de etanol. Anadir 700ul que ya incluye etanol, a la columna. Centrifugar como antes (12Krpm, 1 min) y descartar filtrado. Centrifugar por segunda vez sin añadir wash.

Protocolo- Extracción DNA Plasmido Purificación de Plásmido por Centrifugación Invitrogen Purelink Quick Plasmid Miniprep Kit 7. Eluir – Cambiar la columna a microtubo limpio, añadir 75 ul de TE tibio, (37oC, para disolver particulado que pueda haberse formado en frio (EDTA)) y centrifugar a 12000rpm por 2 min. 8. El DNA plasmido ya esta en el tubo, descartar la columna y guardar el DNA en hielo, 4oC o -20oC

Protocolo- Extracción DNA Plasmido   Estimar concentración por UV espectrofotometría Encender el espectrofotometro Preparar 1 cuveta, una con 1000 ul de TE (blanco) Preparar 1 cuveta con 990 TE y 10 ul de extracción (muestra) Leer a UV - 260nm, 280nm Calcular concentración Calcular pureza

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