JA Cardé, PhD Biol 4207 – Lab Virología UPR Aguadilla Extracción DNA Viral JA Cardé, PhD Biol 4207 – Lab Virología UPR Aguadilla

Objetivos Al concluir esta practica de laboratorio los estudiantes podrán: Establecer diferencias entre extracción de DNA en bacterias y en virus Explicar el racional para los pasos y reactivos en el proceso de aislamiento de DNA viral Realizar una extracción de DNA viral y visualizarla en una electroforesis de agarosa

Introduccion El DNA molécula muy resistente RNA molécula muy lábil transfiere la información genética de generación en generación

Introduccion (cont.) Distintas configuraciones del DNA. Genómico Cromosomas, genomas Extracromosomal Plásmidos, fagos, mitocondrial

Lísis celular Romper la pared, membrana o cápsula Osmótica Enzimática Buffer, sales, agua Enzimática Lisozimas, proteinasa K Mecánica Nitrogeno Sonicadores Homogenizadores

Amortiguador Buffer pH – TAE Quelantes Detergentes Proteasas Frío Inactivar enzimas Detener metabolismo

Amortiguador Buffer pH – TAE pH iones Buffer TAE TBE Conductividad +++ Sobrecalentamiento Inhibidor de enzimas - Separación fragmentos grandes ++ Separacion fragmentos pequenos Tris – alcalino Acetato – acido pH 8.5

Detergente Detergente SDS Cabeza hidrofílica Cola hidrofóbica Disolver grasas SDS sodium docecyl sulfate

Quelante Solución alcalina. Mantener el pH con el amortiguador. Nucleasas de DNA Cationes divalentes Ca+2, Mg+2 Acido etilendiaminotetraacetico Dos lugares para atrapar metales No estarian disponibles para la enzima Inactivar la enzima Insoluble hasta llegar a 8

Extracción Luego de lísis, solución homogénea con mezcla de: Debris celular Proteínas desnaturalizadas, enzimas Carbohidratos, grasas, Acidos nucleicos Centrifugar Remover debris celular Se queda el ADN en la fase acuosa con las proteínas

Extracción - Cloroformo/Fenol Fenol/Cloroformo Proteínas se precipitan Cloroformo no es soluble en agua. Polar disuelve polar No polar disuelve no polar

Purificación: Sales/Isopropanol/Etanol El DNA y RNA se encuentra ahora en agua (polar) Sales y Alcohol mezcla con el agua mejor que con el DNA PLT: DNA y RNA se salen de solución Centrifugar Resuspender RNAsa3765

Almacenar DNA Estabilidad Buffers: Agua TE Temperaturas 4˚C por un año 70˚C por periodos extendidos

Protocolo 1. Comenzar con 500 ul del medio que contiene M13. 2. Añadir 500 ul de fenol/cloroformo/alcohol isoamilico saturado en Tris 3. Mezclar en vortex x 30 segundos 4. Centrifugar a 12,000 rpm por 5 min 5. Transferir fase acuosa (~450ul) a un microtubo. 6. Separar la muestra en 2 microtubos (~200ulc/u)

Protocolo 7. Añadir 1/10 parte del volumen de Acetato de Sodio, pH 4.8; (~20ul) 8. Vortex por 30 segundos 9. Añadir 0.7X del volumen de isopropanol 100% frio!!! ~160 ul Puede detenerse aqui y guardarse a -20oC hasta la proxima clase

Protocolo 10. Centrifugar a 12,000 rpm por 30 min a 4oC. 11. Invertir cuidadosamente para descartar el sobrenadante prestando atención al pellet. 12. Añadir 1ml de EtOH 70%, vortex 13. Centrifugar a 12,000 rpm a 4oC 14. Invertir cuidadosamente para descartar el sobrenadante prestando atención al pellet. - se puede centrifugar unos 30 segundos mas y remover residuos de etanol con micropipeta sin perturbar el pellet.

Protocolo 15. Incubar el microtubo abierto a temperatura ambiente por 15 min, para facilitar evaporación del EtOH. 16. Resuspender el pellet en 25 ul de agua destilada o TE 17. Guardar microtubo bien rotulado a -20oC.