Diseño de cebadores para RT-qPCR ACTIVIDADES 1- Guías Generales para el “Diseño de cebadores para cuantificación de ARNm por RT-qPCR con SYBR-Green” 2- Mostración del diseño de un par de cebadores para cuantificar el factor de transcripción GRF2 de Arabidopsis thaliana 3- Tiempo libre optativo para practica con sus propios diseños

Criterios generales para el diseño de cebadores para RT-qPCR “ESPECIFICIDAD – EFICIENCIA” “ESPECIFICIDAD” -Evitar amplificaciones de ARNm de genes diferentes al de interés -Discriminación entre homólogos -Discriminar de posibles contaminaciones remanentes de ADN genómico “EFICIENCIA” -Lograr la máxima eficiencia de amplificación -Maximizar la detección de los productos de la retrotranscripción

Criterios generales para el diseño de cebadores para RT-qPCR -Guías Generales para el diseño de cebadores -Largo: bases -Contenido de GC:Ideal 40-60% (30-80%) Especial cuidado en el extremo 3´ del cebador -Tm:58°C (57-61 °C) Parejo entre los dos cebadores Parejo con cebadores a usar en paralelo -Evitar mismatches con el molde, especialmente en el extremo 3´ -Evitar A o T en el extremo 3´ -Evitar reducida complejidad de secuencia -Evitar estructuras secundarias -Evitar hibridación entre cebadores hacia el extremos 3´ (no mas de 2 ntds en los últimos 5)

Criterios generales para el diseño de cebadores para RT-qPCR -Guías Generales para el diseño de cebadores -Sitios de hibridación hacia el extremo 3´de la CDS -Utilizar intrones para discriminar amplificación de ADN genómico contaminante XAAAAAAAAAAAA...A VTTTTTTTTTTT

Criterios generales para el diseño de cebadores para RT-qPCR -Guías Generales para el diseño de cebadores -AMPLICÓN: -Amplicon localizado hacia el extremo 3´ del ADNc pares de bases de largo -Contenido de CG entre 40-50% -Evitar estructuras secundarias

Diseño de cebadores para RT-qPCR PASOS: 1- Obtener las secuencias -Secuencia codificante (CDS) y génomica. Definir las posiciones de los intrones -Analizar presencia de splicing alternativo. Si lo hay, decidir que versión se desea medir. 2-Analizar presencia de homólogos en el genoma -Literatura -BLAST contra base de datos de CDS -Alineamiento Múltiple de Secuencias 3-Diseño de cebadores asistido por software 4-Análisis informático y experimental de la calidad de los cebadores

Diseño de cebadores para RT-qPCR HERRAMIENTAS -PRIMER3PLUS Diseño automático de cebadores -CLUSTAL-W Alinamientos múltiples de secuencias -BLAST Búsqueda de homólogos -IDT SciTools Herramientas para Análisis y Diseño de Cebadores -Sequence Massager Herramientas simples de edición de secuencias

Caracterización inicial de los cebadores 1- Determinación de ESPECIFICIDAD 2- Análisis de EFICIENCIA de amplificación

Caracterización inicial de los cebadores 1- Determinación de ESPECIFICIDAD -Realizar reacción de amplificación tipo -Analizar perfil de la curva de melting y geles de agarosa -Optativo: clonado y secuenciación BIEN MAL!!

Caracterización inicial de los cebadores 2- Análisis de la EFICIENCIA de amplificación -Máxima eficiencia redunda en alta exactitud y reproducibilidad. -Es la base para usar el método de cuantificación relativa (2 -  ct )

Caracterización inicial de los cebadores 2- Análisis de la EFICIENCIA de amplificación (y de retrotranscripción) A-Pendiente de la curva de amplificación en la zona de amplificación exponencial Ventaja: -Cálculo directo tubo por tubo (depende del software)

Caracterización inicial de los cebadores 2- Análisis de la EFICIENCIA de amplificación (y de retrotranscripción) B- qPCR con diluciones seriadas al medio del ADNc (o el ARN) -Gráfico ct vs. Log(concentración de molde) -Eficiencia = 10 -(1/pendiente) Pfaffl, Debernardi, 2008 Ventaja: -Permite determinar el rango dinámico cuantitativo de la técnica

Caracterización inicial de los cebadores 2- Análisis de la EFICIENCIA de amplificación (y de retrotranscripción) B- qPCR con diluciones seriadas al medio del ADNc (o el ARN) -Gráfico ct vs. Log(concentración de molde) -Eficiencia = 10 -(1/pendiente) Pfaffl, Debernardi, 2008 Ventaja: -Permite determinar el rango dinámico cuantitativo de la técnica