Centro Nacional de Influenza Depto. de Laboratorios de Salud Publica Diagnóstico de virus Influenza y otros virus respiratorios Toma de muestra clínica, oportunidad, conservación y traslado. Métodos de laboratorio. Centro Nacional de Influenza Depto. de Laboratorios de Salud Publica

Aspectos de la biología del Virus Hay 3 tipos de virus Influenza: A, B y C. Influenza A, dividido en subtipos según la composición de 2 proteínas de la superficie del virus: Hemoaglutinina (H) 16 diferentes Neuraminidasa (N) 9 diferentes Contenido genético: ARN segmentado (8)

Variabilidad Genética (HA y NA) DERIVA ANTIGENICA SALTO ANTIGENICO

El nuevo virus es capaz de replicarse en humanos y causar enfermedad Condiciones para que una variante de influenza sea causa de una pandemia – AÑO 2009 – Influenza A/H1N1v Emerge un nuevo virus de influenza para el cual la población no tiene inmunidad El nuevo virus es capaz de replicarse en humanos y causar enfermedad El nuevo virus puede ser transmitido eficientemente de persona a persona

Centro Colaborador de OMS Centro Nacional de Influenza de Uruguay Red de Centros Nacionales de Influenza Centro Colaborador de OMS Desde 1981 ubicado en el Departamento de Laboratorios de Salud Publica. Es miembro, junto a más de 120 países, del WHO GISN en coordinación con WHO GIP

Roles del Centro Nacional de Influenza Caracterización molecular (Tipificación y subtipificación) Aislamiento viral y caracterización antigénica (subtipificación) Conservación de muestras clínicas y cepas virales Envío de cepas a los laboratorios colaboradores de OMS para caracterización final. Contribución a la reformulación de vacunas antigripales Selección de tipo de muestra clínica Responsable de entrenamientos y asesoramientos Coordinación con Unidad de Vigilancia en Salud Publica (UVISAP)

LABORATORIOS PUBLICOS Y PRIVADOS Muestras clínicas positivas para FLUJOGRAMA DE VIGILANCIA DE LABORATORIO DE VIRUS INFLUENZA EN URUGUAY ESTUDIO DE BROTES LABORATORIOS PUBLICOS Y PRIVADOS Muestras clínicas positivas para Virus Influenza CENTROS CENTINELAS, SERV. INTERNACIÓN ETI, IRAG, Eventos Inusitados CENTRO NACIONAL DE INFLUENZA INFORMACION AL MINISTERIO DE SALUD PUBLICA INFORMACION A FLUNET ENVIO DE CEPAS AISLADAS AL CDC

Situación Clínica (Definición de caso) Muestra de Calidad Técnicas diagnósticas

Muestra de Calidad OPORTUNIDAD: ¿Cuándo tomar la muestra clínica? Modulo 6: Manejo de Laboratorio Muestra de Calidad OPORTUNIDAD: ¿Cuándo tomar la muestra clínica? Hasta 72 horas de iniciado los síntomas TIPO: ¿Cuál muestra clínica? Hisopado Nasal (paciente mayor de 5 años) Aspirado Nasofaríngeo (paciente menor de 5 años) TOMA DE MUESTRA: Conocimiento del procedimiento técnico TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN: Condiciones de conservación y transporte. El tiempo máximo de envío de las muestras al DLSP no puede superar a las 72 horas. 9

Modulo 6: Manejo de Laboratorio Hisopado nasal (HN) Introduzca un hisopo seco por la narina y llévelo hacia atrás, a la nasofaringe Rote el hisopo allí por unos segundos Despacio, retire el hisopo mientras lo hace girar ligeramente Introduzca el mismo hisopo por la otra fosa nasal. Coloque el hisopo en el tubo que contenga medio de transporte viral (MTV), rompiendo el palillo. 10

HISOPADO NASAL Hisopos con punta sintética (poliéster o dacron) y mango de plástico. No son aceptables hisopos con: punta de algodón, alginato de calcio, y mango de madera. No son aceptables: Hisopos bacteriológicos. Para el diagnostico viral son necesarios tener presente ciertos requisitos en cuanto al material usado para realizar la toma de HISOPADO NASAL: solo Hisopos de punta sintética.

Aspirado nasofaríngeo (ANF) Modulo 6: Manejo de Laboratorio Aspirado nasofaríngeo (ANF) Una la trampa de moco con la fuente de vacío Introduzca la sonda a través de las narinas Aplique el vacío Retire despacio la sonda Repita el procedimiento con la otra fosa nasal, usando la misma sonda Después de tomar la muestra, aspire con la sonda el MTV (lavado de la sonda) Retire la tapa con la doble tubuladura y coloque tapón bien cerrado. Acondicione el tubo con las secreciones para el envío para el laboratorio. 12

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ETAPA PRE-ANALITICA Verificar que: la muestra a obtener sea la adecuada y que este acompañada por ficha epidemiológica (nombre, procedencia, edad, fecha de toma, etc ). El envió hacia el laboratorio haya sido correcto :4 °C, triple envoltura ,y rapido. Muestra adecuada: previo envió de la muesta al laboratorio debe existir una comunicación con VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA en MSP dando conocimiento del caso. Rápido: no se deben trabajar muestras que tengan mas de 3 días de hecha la toma.

MEDIO DE TRANSPORTE VIRAL Las muestras se colocan previo envió en Medio Transporte Viral. La finalidad es mantener viable el virus condición necesaria para su posterior caracterización. 1-3 ml por muestras. Compuesto por proteínas estabilizadoras, ATB,antimicoticos y solución buffer. Se adquiere comercialmente ya preparado y alicuotado.

PRUEBAS DE DIAGNOSTICO PARA INFLUENZA Pruebas Rápidas (inmunológicas). Inmunoflurescencia Indirecta (IFI). Amplificación de Ácidos Nucleicos (PCR). Aislamiento (Cultivo celular). Las diferentes pruebas disponibles para detectar el virus Influenza en muestras respiratorias difieren en :sensibilidad,especificidad,disponibilidad,tiempo de procesamiento,y capacidad de distiguir los diferentes tipos (A o B) y subtipos de IA.

Disponibilidad de ensayos diagnósticos de INLUENZA Método Disponibilidad Tiempo Procesamiento Sensibilidad de H1N1v Distingue IA H1N1 de otras IA PRUEBAS RAPIDAS Detección De Ag Amplia Hasta 5 hs 10-70 % No IFD Detección de Ag 24 hs 47-93 % PCR Detección de ARN Limitada 48 hs (procesamiento 2 hs) 86-100 % Si CULTIVO VIRAL Aislamiento Del Virus Hasta 10 días (muy variable) --------- si Los tiempos de procesamiento son aproximados, son dependientes del laboratorio y recursos disponibles.

INMUNOFLURESCENCIA INDIRECTA (IFI) Detección de Antigenos usando: Anticuerpos monoclonales específicos y Anti anticuerpos conjugado a Isotiocianto de Fluoresceína. Panel de Virus Respiratorios : IA, IB, Adenovirus, Virus Respiratorio Sicicial, Parainfluenza 1,2 y 3. Sensibilidad: 65-93 %. Alta especificidad :>96 %. No discrimina diferentes subtipos de Inluenza A. La inmunoflurescencia se utiliza para el diagnostico virológico desde los años 50. Es una de la técnicas rápidas para el diagnostico de infecciones virales agudas. Los Ac se marcan con un flurocromo (I.Flureceina-FITC),pueden detectar Ag virales contra estos. Los flurocromos son excitados por la luz de corta longitud de onda (luz UV) emitida por el microscopio de flurescencia y emite luz de onda mas larga (luz verde). El brillo no especifico es bloqueado por El Azul de Evans. El kit de reactivos viene con todos los Ac. Monoclonales listos para su uso.

Amplificación de ARN por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Extracción de ARN Muestra + Buffer de Lisis La extracción de ARN es el paso inicial para comenzar la PCR. Existen varios metodologías para lograr la extracción de ARN, la actualmente usada en el laboratorio de referencia de Influenza (y recomendada por OMS) es el sistema de Columnas de silica gel de Qiagen. La muestra original se coloca en el primer paso en un buffer de lisis logrando dejar en solución el posible ARN viral,el cual es capturado luego en la columna de silica gel, los sucesivos lavados son para obtener un ARN libre de impurezas, y en el paso final un buffer especial eluye el ARN adherido a la silica gel de la columna. Existen también métodos automatizados para la extracción de ARN y otros métodos manuales.

Donde y como se prepara la PCR Zona Mix o Pre-PCR. Condiciones de frío. Vestimenta y materiales solo de esta zona. No circulación de personal. Preparación de mezcla de reactivos (MIX) . Pipeteo de Mix en eppendorf PCR convencional o en capilares si es PCR en tiempo real. La zona MIX :zona limpia, es un área donde se deben extremar las condiciones de limpieza y esterilidad, todo para evitar posibles contaminaciones. Por ese motivo es necesario hacer una desinfección con alcohol 70 % y colocar 15 minutos de luz UV antes de comenzar a trabajar en ella ,usar sobretunicas ,guantes limpios, y todo el material debe ser exclusivo de la zona como pipetas automáticas y tips con filtro .La no circulación de personal (mas del necesario) es para evitar corriente de aire y asi maximizar el control de contaminación Las condiciones de frío se logran colocando los reactivos (alicutados en eppendorf) en un bloque de frío que se tiene siempre reservado para este fin en un frezzer.

Amplificación propiamente dicha PCR-Tiempo Real Los procesos de amplificación y detección son simultáneos. Equipos compuestos por : termociclador + lector de flurescencia acoplado a un sistema informático. La fluorescencia de cada reacción es proporcional al ADN formado. Los procesos de amplificación y detección del ac. Nucleico se producen de manera simultanea con el mismo vial (capilar en Light Cycler) cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior. Mediante la detección de flurescencia se mide la cantidad de ADN sintetizado en cada momento,y esta fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN formado.

Interpretación de Resultados Sistemas de detección de fluorescencia El incremento de fluorescencia se refleja en curvas de cinética de reacción. Ct o ciclo umbral Los sistemas de detección de fluorescencia son capaces de adquirir y cuantificar la señal emitida por el fluorosforo al final de cada ciclo para cada muestra. Reactivos fluorescentes :1-Intercalantes 2-Sondas 1-Agentes intercalantes:SYBERgreen. 2-Sodas de hidrólisis (TaqMan por ej.),Sondas de horquilla ,Sondas de HIBRIDACION (Light Cycler) Ct o Ciclo umbral ,es el primer ciclo de la PCR en el que se detecta el producto amplificado .Es inversamente proporcional al ARN de partida.

Aislamiento Viral Cultivo en Biosustrato Envió a CDC para caracterización final Colaboración en la reformulación de vacuna antigripal. Sensibilidad alta. Especificidad alta. Aumenta a gran escala el virus. El aislamiento es una técnica de alta sensibilidad para el diagnostico de V.Respiratorios con muestras obtenidas en condiciones correctas. Al aumentar a gran escala el virus permite: la identificación y caracterización antigénica ,prueba de suceptibilidad a fármacos y preparación de vacunas Las células MDCK son las adecuadas para el virus de gripe y se requerirá la adicción de Tripsina como activador de las moléculas HA y garantizar la penetración viral a la célula. La presencia del virus en el cultivo será evidenciado por el efecto citopatico (ECP) que se produce en la monocapa celular, el cual puede demorar hasta 10 días o mas en producirse. ECP es la visualización de los cambios morfológicos mas o menos característicos en las células inoculadas producidas por la acción del virus sobre el cultivo celular.

Algoritmo de procedimientos técnicos CENTRALIZADOS en CNI El ingreso de las muestras desde su desempaque se realiza previa preparación de materiales y desinfección de área de trabajo. Todo dentro de la zona de laboratorio en Cámara de seguridad biológica La vestimenta se realiza dentro de la pre-sala. Primer paso es la verificación de datos de muestras,y luego rotulado con nomenclatura elegida previamente. Son 3 las alícuotas principales : 1-MUESTRA ORIGINAL (respaldo y envió de cepa a CDC ), 2-MUESTRA PARA IFD, 3-MUESTRA PARA EXTRACCION ARN (para PCR) PROCESO DE DESCENTRALIZACION Inmunofluorescencia Indirecta

EQUIPO TECNICO Y HUMANO MsC. Natalia Goñi Lic. Leticia Coppola Lic. Viviana Ramas Lic. Dora Ruchansky Lic. Mariana López Lic. Noelia Morel Lic. Rosa Flieler Lic. Analía Burgueño Aux. Rommy Pilati Aux. Roque Cámera Tec. Silvana Somma Dra. Adriana Varela Dra. Elena Cánepa QF. Maria T Perez Dra. Silvana Brasso Dr. Héctor Chiparelli Centro Nacional de Referencia de Influenza Unidad de Virología – DLSP Avda. Alfredo Navarro 3051 (Acceso Norte) Tel.: 487 25 16/26 16 Fax.: 480 70 14 E-mail: virologiamsp@adinet.com.uy, hchiparelli@msp.gub.uy,