CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Licda. Carol Villatoro de Santistaban Análisis Instrumental Departamento de Fisicoquímica Escuela de Química USAC

¿Por qué? Cromatografía clásica Cromatografía instrumental Más: rapidez, resolución Menos: ensanchamiento de banda  altura de plato teórico Automatización

INSTRUMENTACIÓN Fase estacionaria Fase móvil Muestra Columna Horno Fase móvil Suministro de solventes Desgasificación Bombas Tubería Muestra Inyector Detector

Cromatógrafo básico

Suministro de solventes Solvente libre de partículas y de gases Filtración off-line y on-line Reservorios para varios solventes Programación para mezcla de solventes

Suministro de solventes

Desgasificadores Vacío Destilación Agitación con calentamiento Purga con gas inerte

Programador de gradiente Mezcla de solventes para gradiente Gradiente de alta presión Simple, pero caro Una bomba por solvente Volumen controlado por velocidad de bomba Gradiente de baja presión Barato Una sola bomba Volumen controlado por tiempo de apertura de válvulas

Programación en alta presión

Programación en baja presión

Bombas Altas presiones (>6000 psi) Libre de pulsaciones Amplio intervalo de caudal (0.1-10 ml/min) Reproducibilidad Resistencia a la corrosión Tipos Recíprocas De desplazamiento Neumáticas

Bomba neumática

Bomba neumática Simple Barata Libre de impulsos Ventajas Desventajas Simple Barata Libre de impulsos Primera utilizada, todavía se usa para empacar columnas Capacidad limitada Caudal depende de viscosidad y presión de retorno Presión menor a 2000 psi Sólo condiciones isocráticas Bomba neumática

Bomba de desplazamiento

Bomba de desplazamiento Ventajas Desventajas Flujo independiente de viscosidad y contrapresión Libre de pulsaciones Capacidad limitada Problemática para cambio de solventes Rellenado lento Bomba de desplazamiento

Bomba recíproca

Bomba recíproca Alta presión de salida Ventajas Desventajas Alta presión de salida Adaptable fácilmente a elución con gradiente Caudal independiente de viscosidad y contrapresión Flujo pulsado Bomba recíproca

Recíproca de un pistón

Recíproca de dos pistones

Tubería Ensanchamiento extra columna

Tubería

Columna

Horno

Inyección Características: Volumen pequeño (<500 µL) Sistema a alta presión Problemas de reproducibilidad Variabilidad de volúmenes Vulnerabilidad a abrasión

Inyección

Inyector Septum Resistencia a alta presión (10,000 psi) Acero inoxidable Volumen fijo y constante (5 – 500 µL) Inyector de bucle

Inyector

FIN