CULTIVO CELULAR APLICACIONES EN MEDICINA Centro Comunitario de Sangre y Tejidos del Principado de Asturias. Unidad de Ingeniería Tisular Sara Llames.

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1 CULTIVO CELULAR APLICACIONES EN MEDICINA Centro Comunitario de Sangre y Tejidos del Principado de Asturias. Unidad de Ingeniería Tisular Sara Llames

2 CULTIVO CELULAR CULTIVO CELULAR: mantenimiento, proliferación y/o diferenciación de células in vitro en un medio artificial. REQUERIMIENTOS MÍNIMOS DE UN LABORATORIO DE CULTIVO: Asepsia: cabina de flujo, esterilizador Incubador Nevera/congelador Baño agitador Centrifuga Microscopio Invertido

3 MEDIO DE CULTIVO MEDIO DE CULTIVO : proporciona a las células los nutrientes necesarios.  BASAL: medio definido, adecuado al tipo celular.  SUERO: fuente de proteínas, minerales, lípidos, hormonas, mitógenos.  ANTIBIÓTICOS  ADITIVOS: hormonas, factores de crecimiento, etc. MEDIO DEFINIDO: sin suero, componentes conocidos, reproducible. MEDIO INDEFINIDO: con suero, variación entre lotes.

4 CONDICIONES DE CULTIVO CONDICIONES DE CULTIVO :  pH: 7.4, tamponamiento 5% CO 2  temperatura: 37ºC  humedad: 90-95%INCUBADOR CONTAMINACIÓN BIOLÓGICA:  Bacteriana  Fúngica  MICOPLASMA

5 CULTIVO DE CONDROCITOS

6 Britterg y colaboradores 1994, condrocitos humanos autólogos cultivados para el tratamiento de lesiones completas de cartílago articular. Desde 1997 condrocitos comerciales. Elevado coste. Unidades hospitalarias de cultivo celular.

7 PROCESAMIENTO Y CULTIVO:  Fragmentación mecánica (bisturí)  Digestión enzimática (colagenasa)  Cultivo en presencia de suero autólogo

8 CONTROLES:  Bacteriológicos  Micoplasma: ELISA, PCR, Fluorocromo Cultivo infectado por micoplasma Cultivo negativo

9 Producción de matriz cartilaginosa Producción de matriz cartilaginosa Tinción Safranina Tinción Azul Alcián Inmunodetección de Colágeno II

10 Estudio de normalidad celular Cariotipo Bandas G Hibridación Genómica Comparada.

11 Viabilidad Celular Azul Tripán

12 TRANSPLANTE Y/O CONGELACIÓN  Transplante: suspensión celular en DMEM sin rojo fenol.  Congelación para uso posterior.

13 CULTIVO DE QUERATINOCITOS PIEL ARTIFICIAL

14 CULTIVO DE EPITELIO AISLADO Digestión enzimática Biopsia del paciente Fragmentación mecánica Células aisladas de piel + 3T3 radiados Cultivo primario de queratinocitos Células del cultivo primario + 3T3 radiados Cultivo secundario de queratinocitos Transporte y trasplante

15 LIMITACIONES DEL EPITELIO CULTIVADO:  Fragilidad  Dispasa daña la membrana basal  Formación de ampollas  Infección  Antisépticos  Resultados clínicos pobres  Escasa disponibilidad  Coste elevado

16 completa Modelo de piel artificial completa destinado al tratamiento definitivo de grandes lesiones epiteliales Epidermis Dermis INGENIERÍA TISULAR

17 Biopsia de piel Fragmentación mecánica 1ª Digestión T/E Células aisladas de piel + 3T3 radiados Cultivo de queratinocitos 2ª Digestión colagenasa Cultivo de fibroblastos Cultivos Primarios

18 Cultivo de fibroblastos Cultivo de queratinocitos Plasma humano Dermis artificial basada en plasma humano Piel cultivada Cultivo Secundario

19 PREPARACIÓN DE LA PIEL ARTIFICIAL PARA TRASPLANTE

20 Biopsias procesadas (patologías)