Genética inversa (a veces denominado clonado posicional)

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1 Genética inversa (a veces denominado clonado posicional)
Análisis Genético GENOTIPO FENOTIPO Genética inversa (a veces denominado clonado posicional) Aislamiento de variantes fenotípicas Análisis de descendientes de cruzamientos controlados entre varientas fenotípicas Análisis bioquímico de los procesos celulares controlados por genes concretos Análisis microscópico Análisis del DNA Genética molecular aplicada: usa los principios del conocimiento de la estructura y función del DNA para investigar la base del fenotipo controlado por un genotipo determinado en condiciones normales y patológicas.

2 FLUJO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA

3 SÍNTESIS DE DNA: REPLICACIÓN

4 SÍNTESIS DE RNA Y PROTEÍNAS: TRANSCRIPCIÓN
Y TRADUCCIÓN

5 COMPLEMENTARIEDAD Y ESTRUCTURA TRI-D DEL
DNA

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7 Factores de transcripción: regulan la iniciación de síntesis de RNA
por unión a secuencias de DNA específicas en los promotores

8 DESNATURALIZACIÓN DEL DNA
1. Composición de bases 2. Longitud DNA doble 3. Fuerza iónica Tm ºC = 2(nº A + T) + 4(nº G + C)

9 RENATURALIZACIÓN DEL DNA
Temperatura Fuerza iónica Concentración de DNA Tiempo de reacción Agentes desnaturalizantes: Formamida Urea

10 ENZIMAS METABÓLICOS DEL DNA EN APLICACIONES
Enzimas de restricción Ligasas DNA y RNA polimerasas Nucleasas

11 Los enzimas de restricción son proteínas homodímericas
y reconocen secuencias de DNA palindrómicas BamHI G ' GATCC SITIO INESPECÍFICO SITIO ESPECÍFICO

12 TIPOS DE CORTE PRODUCIDOS POR E. RESTRICCIÓN

13 LIGASAS: formación del enlace fosfo-di-éster

14 EXTRACCIÓN DE DNA Homogenización tejido (Dodecil sulfato sódico SDS; Ác. Etilendiaminotetraacético EDTA; Proteinasa K) Eliminación proteínas (Phenol; Cloroformo) Eliminación RNA (RNAasa) Precipitación (Etanol; Isopropanol en presencia de Na+) Bromuro de metil-trimetil-amonio CTAB

15 EXTRACCIÓN DE RNA DEPC: Dietil pirocarbonato N-Lauril Sarcosina Mercaptoetanol

16 CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE CsCl

17 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
Xileno de cianol 5 Kb Azul de bromofenol 0.5 Kb

18 ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE

19 ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
Acrilamida [CH2=CHCONH2]n Metilen-bis-acrilamida (CH2=CHCONH2)2CH2 En presencia de Persulfato amónico y TEMED (N.N,N’, N’ tetrametiletilendiamina)

20 HIBRIDACIÓN DE SOUTHERN 1. NaOH 1N 2. Tris buffer 3. 20xSSC (NaCl 3M, Citrato Na 0.3M)

21 HIBRIDACIÓN NORTHERN

22 SECUENCIACIÓN DE DNA

23 KARY MULLIS Y LA REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA (PCR) Dos cebadores (oligonucleótidos cortos de DNA de cadena simple) utilizados para amplificar un segmento definido de DNA genómico. Premio Nobel 1993

24 Ventajas de la PCR: especificidad y sensibilidad

25 MECANISMO Y COMPONENTES DE LA PCR
DNA a amplificar (diana) primers (18-25 nts) DNA polimerasa termoestable dNTPs

26 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Desnaturalización Hibridación primers Extensión (síntesis DNA)

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28 Producción PCR = (cantidad DNA inicial) x (1 + % eficiencia) nº ciclos
Eficiencia: % de conversión de DNA molde a producto por ciclo P. ej. con una eficiencia del 70% se obtiene 1 µg a partir de 1 pg en unos 26 ciclos CICLOS COPIAS ,024 ,768 ,048,576 ,554,432 ,073,741,824

29 POLIMERASAS TERMOESTABLES
Pol termoestables: activas despues de repetidamente a 95ºC óptimo a 75ºC Taq: Thermus aquaticus Tli: Thermococcus litoralis Pfu: Pyrococcus furiosus Tth: Thermus thermophilus

30 DISEÑO DE PRIMERS PARA PCR
Longitud de los primers (usualmente nts) Temperaturas de fusión Tm (usualmente 44-55% G-C) No complementariedad entre los dos primers en los extremos 3’ (problema de dímeros de primer) No lazos intracatenarios (carecer de secuencias palindrómicas) Distancia entre primers (ideal entre pb pero hasta 20 Kb)

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32 EFECTO DE LA TEMPERATURA DE HIBRIDACIÓN
EN LA PRODUCTIVIDAD, SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD

33 CONDICIONES DE LA PCR OPTIMIZABLES

34 RT-PCR: OBTENCIÓN DE RNAm

35 SÍNTESIS DE DNAc Síntesis de DNAc primera cadena requiere: RNAm dNTPs primer (oligodT, pDn6 ala azar o específico de un gen) Transcriptasa reversa rTth (DNA pol Thermus thermophilus recombinante) RT AMV (Virus de mieloblastosis de aves) RT MMLV (Virus de la leucemia murina de Moloney)

36 PRIMERS PARA LA SÍNTESIS DE LA PRIMERA CADENA

37 SÍNTESIS DE LA SEGUNDA CADENA
USANDO “AUTOPRIMING”

38 SÍNTESIS DE LA SEGUNDA CADENA USANDO RNAasaH

39 LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERA CON
TRANSCRIPTASA REVERSA (RT-PCR) Combina la reacción de formación de DNAc y la amplificación por PCR. Puede ser de un solo enzima (rTth) o en dos reacciones (primero usando p. ej. AMV-RT y después Taq polimerasa para amplificar el DNAc.

40 APLICACIONES BÁSICAS DE LA RT-PCR
RACE: Amplificación rápida de extremos de DNAc RT-PCR cuantitativa Aislamiento de transcritos que están presentes a diferentes niveles en dos poblaciones de RNAm “differential display” “suppresion substraction hybridization”

41 PROTOCOLO PARA LA RT-PCR RACE

42 PCR CUANTITATIVA 1: RT-PCR COMPETITIVA USANDO UN RNA “MIMÉTICO”

43 RT-PCR CUANTITATIVA 2: EN “TIEMPO REAL”

44 TaqMan probe used in Real Time PCR sample amplification
CT = cycle at which the observed fluorescence is 10-fold above background (10x amplification).

45 DETECCIÓN DE GENES CON EXPRESIÓN DIFERENTE
RT-PCR “Differential display” (DDRT-PCR)

46 RT-PCR “Differential display” (DDRT-PCR)

47 “Suppression subtraction
hybridization” (SSH)