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La reacción de PCR y sus aplicaciones. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

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Presentación del tema: "La reacción de PCR y sus aplicaciones. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)"— Transcripción de la presentación:

1 La reacción de PCR y sus aplicaciones

2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

3 nº ciclos DNA producto primers PCR: cinética

4 RT 92ºC 55ºC 72ºC 92ºC 55ºC 72ºC Desnaturalización: Lo mas corto posible Evita inactivación enzima Anillamiento: Lo mas cerca posible de las Tm de los primers Extensión: Lo mas extenso posible para asegurar fragmentos completos PCR: diseñando ciclos

5 nº ciclos DNA producto primers Enzyme activity PCR: cinética

6 DNA polimerasas termoestables Procesividad: 5-3 actividad de síntesis Fidelidad: 3-5 exonucleasa Adición de As

7 Tiempo de extensión: Taq polimerasa: 2 Kb/min Pfu polimerasa: 0.5 Kb/ min Pwo polimerasa: 1 Kb/min Procesividad

8 Polimerasa 3-5 exoTasa de error% productos con mutación Taq polimerasa NO 8.0x Pfu polimerasa SI 1.3x Pwo polimerasa SI 0.4x Fidelidad en la PCR

9 -A3 5 3A- 5 Adición de As: Taq polimerasa: SI Pfu polimerasa: NO Pwo polimerasa: NO -A3 -T3 3T- -T A ATAT Adición de As

10 Optimización de PCR Parametros del ciclo –Minimo numero de ciclos –Las tres reglas Diseño de oligos –Tms 55-80ºC –No concentrar GC en el extremo 3 Concentración de Mg2+ (0.5-3 mM) –Demasiado da inespecificidad –Poco da poca producción Coadyuvantes –BSA: estabiliza la polimerasa y secuestra inhibidores no especificos –Formamida: Baja la temperatura de desnaturalización (moldes ricos en GC) –DMSO: Ayuda la elongación en moldes ricos en GC Mezcla de polimerasas Hot start

11 Obtener genes –PCR degenerada –PCR reversa Modificar genes –Introducir sitios de restricción –Mutagénesis dirigida –Mutagénesis al azar Algunas aplicaciones

12 ADRGTYKILP 5ACNGCYTGNTGRCGN35NTTNCAYGARTCYTT3 PCR degenerada PCR en condiciones poco estrictas –Temperatura –Mg ++ –Concentracion de oligos Diseño de los primers: –Tamaño minimo (21 mer) –Evitar aminoacidos con mas de un tipo de codon –No mas de tres G o C seguidas en los ultimos tres nucleotidos PCR con primers en solitario

13 PCR reversa

14 Touch-down PCR Nested touch-down PCR PCR reversa

15 X bp Y bp X bpY bp Fragmento A: Z pb Fragmento B: Z -(X+Y)pb Nested PCR

16 Touch-down PCR 94ºC 60-65ºC

17 RE1 RE2 RE1RE2 RE1 RE2 RE1RE2 Introduciendo sitios de restricción

18 RE1 RE2 RE1RE2 RE1RE2 RE1RE2 RE1RE2 RE1RE2 RE1RE2 RE1RE2 RE1RE2 RE1RE2 RE1RE2 PCR en condiciones de baja fidelidad –Desbalance de nucleotidos –Mn ++ en vez de Mg ++ –Polimerasas mutantes Mutagénesis al azar localizada

19 RE1 RE2 MUT1 MUT2 RE1 RE2 RE1+MUT1RE2+MUT2 RE2RE1 Mutagénesis sitio-específica


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