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Publicada porRia Cerezo Modificado hace 9 años
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BACTERIAS ANAEROBIAS INTRODUCCIÓN AL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
BIOQ. MIRTA LITTERIO MICROBIOLOGIA HOSPITAL J.P.GARRAHAN SUBCOMISIÓN DE BACTERIAS ANAEROBIAS-SADEBAC-AAM
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Diagnóstico microbiológico: PRE- aislamiento
Introducción. Anaerobiosis Diagnóstico microbiológico: PRE- aislamiento Características orientadoras en el huésped Muestra: toma y transporte Medios de cultivo y Sistemas de incubación Diagnóstico microbiológico presuntivo a GENERO: POST- aislamiento Características orientadoras en la muestra Prueba de tolerancia al oxígeno y coloración de GRAM Patrones de sensibilidad a discos de antibióticos (con carga especial) Diagnóstico microbiológico a ESPECIE: POST- aislamiento Pruebas de uso frecuente en el laboratorio Implicancia clínica Microbiota normal Factores predisponentes del húesped Infecciones Clostridium difficile Factores de riesgo para el desarrollo de diarrea asociada a C difficile (DACD) Rango de enfermedad entérica Cepas toxigénicas Metodos de diagnóstico de diarrea asociada a C.difficile Tratamiento y Medidas de prevención
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ATMÓSFERAS SU COMPOSICIÓN
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++++ +++ V + ++ AEROBIO ANAEROBIO 80% ATMÓSFERA MICROORGANISMO 60% 40%
20% 0% MICROORGANISMO AEROBIO OBLIGADO ++++ +++ V µ-AEROFILO ANAEROBIO FACULTATIVO AEROTOLERANTE + ++ µ-AEROTOLERANTE
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PRUEBA DE TOLERANCIA AL O2
JARRA ANAEROBIA AGAR SANGRE ANAEROBIO AEROBIO….??? ANAEROBIO ….??? PRUEBA DE TOLERANCIA AL O2
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CARACTERÍSTICAS ORIENTADORAS DE LA PRESENCIA DE ANAEROBIOS
FACTORES PREDISPONENTES DEL HUESPED TRAUMA MALA IRRIGACIÓN, HIPOXIA DAÑO TISULAR, NECROSIS, TEJIDO DESVITALIZADO MUCOSA DAÑADA MECANISMOS DE DEFENSA AUSENTES (P/E: REFLEJOS DE DEGLUCIÓN) ENFERMEDAD DE BASE (P/E: DIABETES)
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TOMA Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS X ANAEROBIOS
CONDICIONADOS POR INTOLERANCIA AL O2 MICROBIOTA HABITUAL
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MICROBIOTA NORMAL Propionibacterium acnes
PIEL CAVIDAD ORAL Y TRS Propionibacterium acnes Peptoniphilus asaccharolyticus Bacilos gram-negativos: Porphyromonas Prevotella, Fusobaterium nucleatum – Cocos gram-positivos, Actinomyces 100:1 (ANA/AER) TRACTO GENITAL FEMENINO COLON Bacilos gram-negativos: Bacteroides grupo fragilis– Cocos gram-positivos - Clostridium, Eubacterium, Bifidobacterium 1000:1 (ANA/AER) Bacilos gram-negativos: Porphyromonas Prevotella bivia-disiens, Cocoss gram-positivos Lactobacillus - Clostridium
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TOMA DE MUESTRAS PUNCION ASPIRACION CIRUGIA EVITANDO “FLORA INDIGENA”
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TOMA DE MUESTRAS Decontaminación previa de la zona con alcohol 70%
Aplicación de tintura de yodo (30 segundos) o solución acuosa de yodo (un minuto) Remoción de la preparación de yodo con alcohol 70%
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TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS
MODALIDAD EVITANDO AIREACIÓN TIEMPO DE SOBREVIDA LÍQUIDAS VOLUMENES PEQUEÑOS VIAL DE TRANSPORTE (TAB) RASPADOS HISOPADOS TEJIDOS PEQUEÑOS TUBOS MEDIO STUART CARY-BLAIR PRE-REDUCIDO 8-24 HS A TEMPERATURA AMBIENTE TEJIDOS GRANDES TUBO SECO ESTERIL EN BOLSA DE PLASTICO CON GENERADOR DE ANEROBIOSIS
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TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS
AIREADAS TIEMPO DE SOBREVIDA MUESTRA !! LÍQUIDAS < 1 ml = 1 ml > 2 ml < 10 min = 30 min > 2-3 hs !! TEJIDOS PEQUEÑOS <1 cm3 ≤ 30min TEJIDOS GRANDES >1 cm3 2-3 hs TEMPERATURA AMBIENTE
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SIEMBRA EN ANAEROBIOSIS
MEDIOS SOLIDOS NO SELECTIVOS AGAR SANGRE ANAEROBIO (ASA) Agar base (Columbia,TSA,BHI, etc) suplementado: sangre lacada, vitamina K, hemina, CO3H-, extracto de levadura, tween 80, piruvato, etc. SELECTIVOS y/o DIFERENCIALES FEA, BBE, KVLB, EYA, etc
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SIEMBRA EN ANAEROBIOSIS
MEDIOS LÍQUIDOS CALDO CEREBRO CORAZÓN CALDO TIOGLICOLATO suplementado: vitamina K, hemina, CO3H-, extracto de levadura, tween 80, piruvato, etc SELLAR VASELINA-PARAFINA (3/2) SIN SELLAR COLUMNAS ALTAS
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INCUBACIÓN EN ANAEROBIOSIS
JARRA PLACAS OXYRASA JARRA GENERADORES DE ANAEROBIOSIS BOLSAS CÁMARA
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PROCESAMIENTO INICIAL MUESTRA
AGAR SANGRE ANAEROBIO (ASA) COLORACIÓN DE GRAM BOLSAS JARRA ANAEROBIA CALDO ANAEROBIO INCUBAR 48 HS 37ºC
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CARACTERÍSTICAS ORIENTADORAS DE LA PRESENCIA DE ANAEROBIOS
MUESTRA--MACROSCÓPICAS COLOR OLOR PRESENCIA DE GRANOS MUESTRA—MICROSCÓPICAS—COLORACIÓN DE GRAM Ef ASOCIACIÓN FUSO ESPIRILAR HEMOCULTIVO BG(+) “ARAÑITAS” GANGRENA BG(+) RECTANGULARES
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EXAMINACIÓN DE LOS CULTIVOS
PLACAS DE SIEMBRA PRIMARIA CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS del CULTIVO OLOR PIGMENTO (NEGRO-MARRÓN) FORMA Y ASPECTO DE LAS COLONIAS ASA PIGMENTO NEGRO ASA BBE/ASA
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PRUEBA DE TOLERANCIA al O2
ESTRIAR (37ºC) HS DE INCUBACIÓN RESULTADOS 2 ACH 2 1 1 1 3 3 2 AE/ANA FAC 5 3 5 4 4 4 ACH 5 2 2 1 ASA PLACA CON SIEMBRA PRIMARIA ASA 3 1 5 ANAEROBIO 3 4 5 ASA 4 POR LO MENOS 2 VECES
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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO
2 ASA GRAM DE COLONIA 1 3 ANAEROBIO 5 4 CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE COLONIAS BORDES PIGMENTO (NEGRO/MARRÓN) CONSISTENCIA (SECA/MUCOSA)
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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO
2 ASA ASA 1 3 ANAEROBIO 5 0.5 MF 4 V 5µ K 1000µ Co 10µ B 20% SPS 5% MTZ DISCOS GRAM BGN CGN BGPNE BGPE CGP RS V S R
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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO
GRAM NEGATIVOS BACTEROIDES GRUPO FRAGILIS BACTEROIDES GRUPO UREALYTICUS FUSOBACTERIUM SPP PORPHYROMONAS SPP PREVOTELLA SPP OTROS BACTEROIDES OTRAS PREVOTELLA VEILLONELLA SPP BACILOS COCOS
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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO
5µ K 1000µ Co 10µ B 20% Bacteroides grupo fragilis R BACILOS GRAM (-) B fragilis B distasonis B ovatus B thetaiotaomicron B eggerthii B stercoris B caccae B merdae B uniformis B vulgatus B splanchnicus NUEVAS spp.* B goldsteinii B nordii B salyersiae
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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO
5µ K 1000µ Co 10µ B 20% Porphyromonas spp. S R Prevotella spp. RS BACILOS GRAM (-) pigmentados PIGMENTO NEGRO / MARRÓN FLUORESCENCIA ROJA UV 365
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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO
5µ K 1000µ Co 10µ B 20% Bacteroides grupo ureolyticus like R S BACILOS GRAM (-) B. ureolyticus Campylobacter gracilis C rectus Bilophila wadsworthia Suterella wadsworthensis
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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO
5µ K 1000µ Co 10µ B 20% Fusobacterium spp. R S BACILOS GRAM (-) F nucleatum F necrophorum F varium F mortiferum F ulcerans
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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO
5µ K 1000µ Co 10µ B 20% Prevotella spp. NO PIGMENTADAS R RS S Bacteroides spp. BACILOS GRAM (-) P buccae P oris P heparinolytica P zoogleoformans P dentalis P oralis group P enoeca P bivia P disiens
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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO
5µ K 1000µ Co 10µ B 20% Veillonella spp. R S Acidaminococcus fermentans Megasphera elsdenii COCOS GRAM (-) PENICILINA 10 µg
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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO
GRAM POSITIVOS BACILOS 1 ESPORULADOS CLOSTRIDIOS 2 NO ESPORULADOS LACTOBACILOS, EUBACTERIUM, ACTINOMYCES, PROPIONIBACTERIUM COCOS PEPTOSTREPTOCOCOS, PEPTOCOCOS FINEGOLDIA SP., MICROMONA SP.
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O2 IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO BACILOS GRAM (+)
5µ Co 10µ MTZ O2 BG(+)ESPORULADO= CLOSTRIDIOS S R SR BG(+)NO ESPORULADO BACILOS GRAM (+) C perfringens C difficile C septicum C sordelli C botulinum C tetani C butyricum C tertium C histolyticum Actinomyces spp. Bifidobacterium spp. Eubacterium spp. Eggerthella sp. Filifactor spp. Lactobacillus sp. Mobiluncus spp. Propionibacterium spp. Rothia sp. AEROTOLERANTES A
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O2 IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO COCOS GRAM (+) COCOS G (+) V 5µ Co
10µ SPS 5% MTZ O2 COCOS G (+) S R RS COCOS GRAM (+) Peptostreptococcus anaerobius Micromonas micros Peptococcus niger Finegoldia magna Anaerococcus spp. Peptoniphilus spp. Gallicola spp. SPS = S
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Yuli Song et al.;JCM Vol45 N2.2007
IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO V 5µ Co 10µ SPS 5% MTZ O2 COCOS G (+) S R RS COCOS GRAM (+) Peptostreptococcus anaerobius P.stomatis P.micros Peptococcus niger Finegoldia magna Anaerococcus spp. Grupo I Grupo III SPS = S Yuli Song et al.;JCM Vol45 N2.2007
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Tabla 1- Identificación de Anaerobios: patrones de discos de potencia especial
Microorganismo Vc Kn Co Bi SPS MTZ Gram-negativos R1 V Bacteroides grupo fragilis R Prevotella spp. R/S S/R S Porphyromonas spp. Fusobacterium spp.2 Bacteroides grupo ureolyticus3 Veillonella spp. Gram-positivos S4 Cocos gram-positivos R5 Clostridium spp. 1- Porphyromonas spp. son Vc S. 2- Nitrato negativo, 3- incluye Campylobacter spp. 4- Algunas cepas de lactobacilos y la mayoría de Clostridium innocuum son R a Vc (5µg). 5- Peptostreptococcus anaerobius y algunas cepas de Micromonas micros son S. Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Bacteriology Manual, 6th edition. 2002
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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE ESPECIE
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METODOS CONVENCIONALES-PRUEBAS
IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE ESPECIE METODOS CONVENCIONALES-PRUEBAS REQUERIMIENTO DE FORMATO/FUMARATO COAGULACIÓN / DIGESTIÓN DE LECHE CRECIMIENTO CON BILIS AL 20% FERMENTACIÓN DE AZÚCARES REDUCCIÓN DE NITRATOS FLUORESCENCIA CAMP REVERSA MOVILIDAD PYR PRODUCCIÓN DE INDOL LIPASA LECITINASA CATALASA DESULFOVIRIDINA FOSFATASA ALCALINA ARGININA DIHIDROLASA L-PROLINA AMINOPEPTIDASA HIDRÓLISIS DE UREA ESCULINA GELATINA
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MICROBIOTA NORMAL COLONIZACIÓN DEL RECIÉN NACIDO CAVIDAD ORAL
TRACTO INTESTINAL TRACTO GENITAL
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FACTORES PREDISPONENTES DEL HUESPED
GENERALES DIABETES CORTICOSTEROIDES ENFERMEDADES MALIGNAS COLAGENOPATIAS DROGAS CITOTÓXICAS INMUNOSUPRESIÓN ESPLENECTOMÍA NEUTROPENIA HIPOGAMAGLOBULINEMIA MECANISMOS DE DEFENSA ALTERADOS (P/E REFLEJOS DE DEGLUCIÓN) LOCALES BAJO POTENCIAL REDOX INSUFICIENCIA VASCULAR ANOXIA TISULAR DESTRUCCIÓN TISULAR CUERPO EXTRAÑO
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INFECCIONES ASOCIADAS
ENDÓGENAS RELACIONADAS A MUCOSAS RELACIONADAS A LA MICROBIOTA NORMAL POLIMICROBIANAS EXÓGENAS CLOSTRIDIALES NO CLOSTRIDIALES
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INFECCIONES ASOCIADAS
SISTEMA NERVIOSO CENTRAL ABSCESO INTRACRANEANO (EMPIEMA SUBDURAL) (ABSCESO CEREBRAL) ABSCESO EPIDURAL INFECCIONES EN PACIENTES CON SHUNT VENTRICULO-PERITONEAL
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INFECCIONES ASOCIADAS
CAVIDAD ORAL MUCOSITIS GINGIVITIS PERIODONTITIS
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INFECCIONES ASOCIADAS
TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR OTITIS MEDIA CRÓNICA COLESTEATOMA MASTOIDITIS CRÓNICA SINUSITIS CRÓNICA
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INFECCIONES ASOCIADAS
TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR NEUMONÍA ASPIRATIVA ABSCESO PULMONAR EMPIEMA PLEURAL
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INFECCIONES ASOCIADAS
ABDOMEN PERITONITIS ABSCESOS INTRAABDOMINALES ENTEROCOLITIS NECROTIZANTE COLANGITIS
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INFECCIONES ASOCIADAS
TRACTO URINARIO ABSCESO PERINEFRÍTICO ABSCESO INTRARRENAL
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INFECCIONES ASOCIADAS
PIEL Y PARTES BLANDAS ABSCESO CUTÁNEO ONFALITIS ULCERAS DE DECÚBITO ABSCESO PILONIDAL MORDEDURAS
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INFECCIONES ASOCIADAS
HERIDAS Y TEJIDO NECRÓTICO CELULITIS FASCITIS GANGRENA IMPÉTIGO COMPARTIMIENTOS DE LA PIEL EPIDERMIS DERMIS CELULAR SUBCUTANEO FASCIA MUSCULAR ERISIPELA CELULITIS FASCITIS FOLÍCULO PILOSO FOLICULITIS
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INFECCIONES ASOCIADAS
HUESO-ARTICULACIONES ARTRITIS CRÓNICA OSTEOMIELITIS CRÓNICA SECUNDARIAS A TRAUMATISMOS EXTERNOS APARATO GINECOLÓGICO SALPINGITIS ENDOMETRITIS INFECCIÓN PELVIANA ABORTO SÉPTICO VAGINOSIS BACTERIANA SEPSIS-BACTERIEMIAS FOCO ABDOMINAL
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DIARREA ASOCIADA A C difficile
CAUSA MAS FRECUENTE DE DIARREA NOSOCOMIAL EN PAISES DESARROLLADOS PREVALENCIA 10-17% HÁBITAT NATURAL: MEDIO AMBIENTE, SUELO, HECES. PORTACIÓN: NEONATOS % 2 AÑOS < 4% AMBULATORIO-SANO % HOSPITALIZADO SEM % 4 SEM %
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DIARREA ASOCIADA A C difficile
SIGNOS Y SINTOMAS ASINTOMÁTICA DIARREA (LEVE A SEVERA) COLITIS COLITIS PSEUDOMEMBRANOSA MEGACÓLON TÓXICO PERFORACIÓN INTESTINAL MUERTE
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DIARREA ASOCIADA A C difficile
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DIARREA ASOCIADA A C difficile
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DIARREA ASOCIADA A C difficile
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FACTORES DE RIESGO DACD
DIARREA ASOCIADA A C difficile FACTORES DE RIESGO DACD ANTIBIOTICOS PREVIOS ANTINEOPLASICOS ENF DE BASE SEVERA INTUBACIÓN NASOGÁSTRICA INH. DE LA BOMBA DE PROTONES EDAD ≥ 65 AÑOS HOSPITALIZACION PROLONGADA PAC QUIRÚRGICOS > PAC. MÉDICOS
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DIARREA ASOCIADA A C difficile
CEPA TOXIGÉNICA NO TOXIGÉNICA A= ENTEROTOXINA tcdA B= CITOTOXINA tcdB A + B + A – B + A – B – S I DACD NO DACD
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DIARREA ASOCIADA A C difficile
CEPA PREVALENCIA TOXIGÉNICA 0.2 % USA 3% UK 12.5% JAPÓN 24.1% ARGENTINA 31% POLONIA A – B + S I DACD
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CEPA epidemica USA / EUROPA - NAP1
DIARREA ASOCIADA A C difficile 2002 CEPA epidemica USA / EUROPA - NAP1 A= ENTEROTOXINA X 16 B= CITOTOXINA X 23 Deleción 18pb en el gen tcdC, gen regulador negativo de los genes de la tox Ay B CDT=TOXINA BINARIA actin-specific ADP-ribosyltransferasa ¿¿¿¿¿¿Asociada a mayor virulencia ????? R a gatifloxacina R a moxifloxacina
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DIARREA ASOCIADA A C difficile
Ejemplo de diferentes denominaciones de Cd según tecnica empleada para su caracterización C difficile características TECNICA PCR*** Ribotipo Toxinotipo PFGE** REA* A+ B CDT+ Casos fatales Canada 027 III NAP 1 BI A- B+ 017 VIII CF Hallado en alimentos humanos y animales V BK Brotes hospitalarios en USA + Clinda O J *REA Analisis x endonucleasas de restricción (grupos: BI,J,K,G,Y,CF,BK) **PFGE Electroforesis en gel de campo pulsado ***PCR Reacción en cadena de la polimerasa EPIDEMICA
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DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
DIARREA ASOCIADA A C difficile DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DE LABORATORIO DETECCIÓN DE LAS TOXINAS A Y/O B DIRECTAMENTE EN MATERIA FECAL. DE CEPA AISLADA DE C DIFFICILE POR CULTIVO
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DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
DIARREA ASOCIADA A C difficile DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DE LABORATORIO DETECCIÓN DE LAS TOXINAS A Y/O B MATERIA FECAL: FRESCA. CONSERVACION: HASTA 2 DÍAS ºC ≥72 HS / -70ºC ( INACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA DE TOXINA )
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DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
PRODUCTO DETECTADO TIEMPO CORRELACIÓN CLÍNICA Cultivo celular Toxina B 24-48 hs. Máxima sensibilidad Buena especificidad Aglutinación con Látex Glutamato (GDH) deshidrogenasa 30 min. Baja sensibilidad Baja especificidad EIE Toxina A A-B+ Toxinas A y B 2-4 Regular sensibilidad Buena especificidad Inmunoblot Toxina A A-B+ En estudio PCR Gen toxina B Buena sensibilidad Regular especificidad
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DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
CULTIVO EN LINEA CELULAR = METODO PATRÓN ENSAYO DE CITOTOXICIDAD POSITIVO EFECTO CITOPÁTICO (-) EFECTO CITOPÁTICO (+) MATERIA FECAL o Clostridium difficile TOXINA B (+) EXTRACTO + ANTITOXINA EXTRACTO CULTIVO CELULAR FIBROBLASTOS
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MUESTRA PARA CULTIVO BACTERIOLÓGICO
DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS MUESTRA PARA CULTIVO BACTERIOLÓGICO MATERIA FECAL ETANOL CCFA + SANGRE C difficile recuperado 30 MIN /T AMB. ANAEROBIOSIS 24-48HS SHOCK ETANÓLICO DETECCIÓN DE TOXINA
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DIARREA ASOCIADA A C difficile
TRATAMIENTO DACD 1- PACIENTES COLONIZADOS NO PROFILAXIS
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TRATAMIENTO DACD DIARREA ASOCIADA A C difficile
2- PACIENTES INFECTADOS: DISCONTINUAR TRATAMIENTO ANTIBIÓTICO
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DIARREA ASOCIADA A C difficile
TRATAMIENTO DACD 2- PACIENTES INFECTADOS: ENFERMEDAD LEVE S/SINTOMAS SISTÉMICOS DIARREA LEVE MTZ-4X(250mgVO)X10d MTZ-3X(500mgVO)X10d ENFERNEDAD MODERADA FIEBRE LEUCOCITOSIS DIARREA PROFUSA DOLOR ABDOMINAL VANCOMICINA 4X( mgVO)X10d SEVERA ILEO PARALÍTICO MEGACOLON TÓXICO DESHIDRATACIÓN SÉPSIS CIRUGIA ? VANCOMICINA INTRALUMINAL INHABILIDAD TTO ORAL CON/SIN MTZ EV
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DIARREA ASOCIADA A C difficile
EVOLUCIÓN DACD BUENA MEJORÍA CLÍNICA 1-2 DIAS DE INICIADO TTO FIEBRE RESUELVE EN HS DIARREA RESUELVE EN 2-5 DIAS NO REPETIR DETECCIÓN DE TOXINAS PARA DEMOSTRAR CURA PORTADOR ASINTOMÁTICO
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RECAIDA antes de los 2 meses REINFECCIÓN despues de los 2 meses
DIARREA ASOCIADA A C difficile EVOLUCIÓN DACD RECAIDA antes de los 2 meses REINFECCIÓN despues de los 2 meses 12-24% PACIENTES DESARROLLAN UN 2 do E P I S O D I O D E D A C D +/- 2 MESES DEL DIAGNÓSTICO INICIAL
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DIARREA ASOCIADA A C difficile
MEDIDAS DE PREVENCIÓN PERSONA LAVADO DE MANOS AGUA Y JABÓN GUANTES GUARDAPOLVO HABITACIONES PRIVADAS COHORTIZAR EN AERAS DESIGNADAS LAVANDINA MEDIO AMBIENTE
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Vaya hasta el fin... ¡LUCHE!
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