Reacción de ligación: Requieren de ATP y Mg++ T4 DNA ligasa

Presentación del tema: "Reacción de ligación: Requieren de ATP y Mg++ T4 DNA ligasa"— Transcripción de la presentación:

1 Reacción de ligación: Requieren de ATP y Mg++ T4 DNA ligasa Extremos cohesivos > extremos romos Liga oligos DNA y RNA a híbridos DNA-RNA DNA Ligasa de E. coli Muy baja eficiencia extremos romos No liga RNA a DNA.

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3 Reacción de ligación: Corte son 1 ER: Vector + inserto
Inserto derecho, inserto invertido, concatémeros de inserto Vector religado Vector-Vector Defosforilación del vector Relación molar inserto-vector Clonado direccionado

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5 Relación molar Plásmido aprox 7 Kb Fragmento aprox 1.2 Kb
Relación 5.8 veces Colocando 50 ng de vector Fragmento 50: 5.8= 8.6 ng para relación 1:1

6 TRANSFORMACION Y SELECCION
Bacterias competentes: Métodos químicos: Cl2Ca, DMSO, etc Eficiencia:107 cel/mg DNA Métodos físicos: Electroporación (pulsos electricos ) Ef: 108cel/mg DNA SELECCIÓN Presión de selección : crecimiento en presencia de antibiótico

7 Transformación química

8 Controles Bacterias en medio con antibiótico (viabilidad)
Bacterias en medio sin antibiótico (resistencia) Ligación vector sin ligasa (vector no cortado) Ligación vector solo con ligasa (vector no cortado y vector cortado con una sola enzima) Vector cerrado de concentración conocida (eficiencia de transformación)

9 Transformación electroporación

10 Electroporación