La descarga está en progreso. Por favor, espere

La descarga está en progreso. Por favor, espere

Clonación Manipulación de DNA Curso 2011-12. El problema básico ¿Cómo mantener estable un fragmento de DNA dentro de una célula? Uniéndolo a un vector.

Presentaciones similares


Presentación del tema: "Clonación Manipulación de DNA Curso 2011-12. El problema básico ¿Cómo mantener estable un fragmento de DNA dentro de una célula? Uniéndolo a un vector."— Transcripción de la presentación:

1 Clonación Manipulación de DNA Curso

2 El problema básico ¿Cómo mantener estable un fragmento de DNA dentro de una célula? Uniéndolo a un vector de clonacion

3 Vector de clonacion Fenotipo seleccionable Dianas de restricción unicas Multicopia DNA de replicación autónoma

4 Diana única

5

6

7 Plásmidos recombinantes Quimeras

8 Pasos en la clonación Ligación Crecimiento en placas de agar en medio selectivo Restricción del vector y del inserto Transformación

9 Fragmentación de DNA Enzimas de restricción

10 Werner Arber Premio Nobel de Medicina en 1978 "for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics".

11

12 Eje de simetría doble dabalearrozalazorraelabad DIANAS de restricción Secuencias palindrómicas anaanna

13

14 RomosProtuberantes

15 Probabilidad de corte 1/4 x 1/4x 1/4 x1/4= (1/4) 4 =1/256 (1/4) 6 = 1/4096 (1/4) 8 = 1/65536 ~ 12.5x10 6 fragmentos ~ fragmentos ~ fragmentos Nº fragmentos en genoma humano Enzimas de restricción nomenclatura /4

16 Isosquizómeros Enzimas de restricción que reconocen la misma sequencia Pueden cortar en el mismo sitio Como NdelI y MboI GATC O no NarI GG CGCC BbeI GGCGC C EheI GGC GCC KasI G GCGCC

17 Ligación de DNA

18 5´ 3´

19 Animaciones> manipulación de DNA> techniques> cutting & pasting

20 Truco para favorecer la formación de recombinantes Impedir la religación del vector

21

22 Extremos cohesivos compatibles ¿Podríamos digerir el recombinante con BamHI?

23 ….NGAT ATCN….. ….NCTATAGN….. ….NGAT ….NCTA ATCN….. TAGN….. ….NCTA ….NGAT CCTN….. GGAN….. ….NCTA ….NGATCCTN….. GGAN…..

24 Animación > Manipulation >Revolution > Players Premio Nobel de Química 1980

25 Vectores de clonacion Vectores plasmídicos

26 Características de los vectores de clonación Pequeño tamaño Marcador genético de selección Sitios únicos de restricción

27 ColE1

28

29

30

31

32

33 Mutación en las secuencias control de la replicación de ColE1 resultantes en más de 500 copias/célula Adición de múltiples sitios de clonaje únicos (MCS) (poly-linker) Vectores mejorados

34 MCS (Multi Cloning Site)

35

36 (polylinker)

37 MCS de pUC18

38 MCS de pUC19

39 MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la - galactosidasa.

40 pUC P lac O N-lacZ pUC P lac O N-lacZ IPTG XGal

41

42 pUC P lac O N-lacZ pUC P lac O N-lacZ IPTG XGal

43 Allolactosa Isopropil D tiogalctósido IPTG INDUCTOR no hidrolizable Inductor

44 X-gal Ensayo de -galactosidasa

45 MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la - galactosidasa. Selección de plásmidos con inserto: colonias blancas en placas con IPTG y X-Gal.

46 Colonias blancasColonias azules + X-gal

47 + IPTG Animación> clonación / clonación (vectores plasmídicos)

48 + inserto - inserto

49 Vectores lanzadera Shuttle

50


Descargar ppt "Clonación Manipulación de DNA Curso 2011-12. El problema básico ¿Cómo mantener estable un fragmento de DNA dentro de una célula? Uniéndolo a un vector."

Presentaciones similares


Anuncios Google