TRANSFORMACIÓN.

Presentación del tema: "TRANSFORMACIÓN."— Transcripción de la presentación:

1 TRANSFORMACIÓN

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3 Fred Griffith 1928, sus estudios los realizó en Streptococcus pneumoniae
Conclusión: Las células R “absorbieron” “algo” de las células S “principio transformante”

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5 El Principio transformante es DNA

6 TRANSFORMACIÓN CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA INTRODUCCIÓN DE UN DNA EXÓGENO Puede ser NATURAL (se han encontrado aproximadamente 40 especies que pueden realizar este proceso) ARTIFICIAL (INDUCIDA)

7 Algunas hipótesis que no son excluyentes…..
TRANSFORMACIÓN ¿Para qué tomar DNA exógeno?.... Grandes maquinarias proteícas intervienen en el proceso de transformación Algunas hipótesis que no son excluyentes….. Para la diversidad genética (por ejemplo: obtener resistencia a antibióticos) II. Para la reparación de DNA III. Como nutrientes: El DNA es fuente de carbono, nitrógeno y fósforo

8 SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS TRANSFORMACIÓN vs CONJUGACIÓN
¿existe DNA libre en todos los ambientes, es estable?

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10 TRANSFORMACIÓN NATURAL, las bacterias más estudiadas son
GRAM + Streptococcus pneumoniae Bacillus subtilis GRAM - Neisseria gonorrhoeae Haemophilus influenzae El proceso de transformación se puede dividir en 2 ETAPAS ETAPA 1: Desarrollo de un estado competente ETAPA 2: Procesamiento del DNA Unión Importe Recombinación

11 Velocidad de transferencia: 90-100 nucleótidos/segundo a 30°C
Etapa 1: Desarrollo de un estado competente ¿Qué es una célula competente? Estado fisiológico inducible Factores que inducen el estado de competencia en la transformación natural: Limitación en los nutrientes Mitomicina C Alta densidad celular Temperatura, pH La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de competencia Velocidad de transferencia: nucleótidos/segundo a 30°C

12 La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de competencia

13 ANTES se debe formar el pseudopili que atraviesa la pared celular
Transporte DNA en Gram + ANTES se debe formar el pseudopili que atraviesa la pared celular Unión del DNA a la superficie por interacción con proteínas (++) del pseudopili 2. Unión a receptor: ComEA (no es secuencia específica) 3. Fragmentar y degradar la cadena que no se transporta 4. Se ha encontrado una endonucleasa en membrana ComEC: canal en la membrana ComFA: unión a ATP

14 Sistema de secreción tipo II
Transporte DNA en Gram + El pili debe cruzar la membrana interna, el espacio periplásmico y la membrana externa Se ha sugerido que el reconocimiento es secuencia específica: (5´GCCGTCTGAA-3´) Pili tipo IV: Sistema de secreción tipo II

15 ¿es más fácil por conjugación?
Una vez que ingresó el DNA de cadena sencilla ¿qué ocurre dentro de la célula? ¿DE MANERA NATURAL es fácil intercambiar plásmidos entre bacterias por transformación? ¿es más fácil por conjugación?

16 TRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL
El “caballito de batalla” es la bacteria Escherichia coli Es una técnica fundamental en biología molecular: clonación y generar organismos transgénicos

17 TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
VECORES GENÉTICOS: molécula de DNA que es usada como vehículo para transportar segmentos de DNA foráneo en una célula huésped,

18 PLÁSMIDOS

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20 OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A KANAMICINA
Escherichia coli Medio LB + KANAMICINA

21 En la transformación artificial ¿cómo se induce el estado competente de una bacteria?
1. Tratamiento químico 2. Electroporación

22 Incubar toda la noche a 37°C
Preparar células competentes de E. coli E. coli A= 0.6 – 0.8 a 600 nm 3 mL medio Luria Incubar toda la noche a 37°C

23 Preparar células competentes de E. coli
5 mL CaCl2 3 mL NaCl Resuspender Resuspender 5000 r.p.m min °C CÉLULAS COMPETENTES 2500 r.p.m min Incubar 20 min

24 LA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICO
Inmediatamente en hielo 42°C 70 s 1 hr Incubar a 37°C con agitación por 45 min 1 mL medio SOC

25 Buffer TE, CaCl2 y PLÁSMIDO
CÉLULAS COMPETENTES PLÁSMIDO: DNA EXÓGENO Buffer TE, CaCl2 y PLÁSMIDO

26 Al final de la transformación

27 Utilizaremos el plásmido pET-TEM
Sitio múltiple de restricción Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina fosfotransferasa Origen de replicación

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29 Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:
La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas generalmente codificadas por plásmidos. La inactivación de los aminoglucósidos se hace por: Adenilación de grupos hidroxilo. Fosforilación de grupos hidroxilo. Acetilación de grupos amino. ENZIMA INACTIVADORA AMINOGLUCÓSIDO INACTIVADO: Gentamicina adeniltransferasa Gentamicinas, Sisomicina, Kanamicinas, Tobramicina. Gentamicina acetiltransferasa Netilmicina, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina. Kanamicina acetiltransferasa Netilmicina, Amikacina, Neomicina, Kanamicinas, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina. Neomicina, Kanamicina fosfotransferasa Gentamicina A, Neomicina, Kanamicina

30 MECANISMO PROPUESTO PARA LA ENTRADA DE DNA EXÓGENO EN BACTERIAS COMPETENTES DE E. coli
ANIMACIÓN

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32 Medio Luiria + KANAMICINA
Células no transformantes Células transformantes Medio Luiria + KANAMICINA

33 ESQUEMA GENERAL SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio