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ESQUEMA GENERAL SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS.

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Presentación del tema: "ESQUEMA GENERAL SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS."— Transcripción de la presentación:

1 ESQUEMA GENERAL SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina

2 OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A KANAMICINA Medio LB + KANAMICINA Escherichia coli

3 Se introducirá el vector pET-TEM Sitio múltiple de restricción Origen de replicación Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina fosfotransferasa

4 PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS Niveles de impurezas aceptados por la FDA Ccc: supercoiled circular covalently closed Oc: open circular

5 Plásmidos La diferencia en TAMAÑO entre el DNA cromosomal y el DNA plasmídico permite desarrrollar estrategias de purificación

6 TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento

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9 PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS Niveles de impurezas aceptados por la FDA Ccc: supercoiled circular covalently closed Oc: open circular

10 Purificación de plásmidos 1. Lisis Química Mecánica Cambios en la Tempratura 2. Remover partículas grandes Centrifugación Filtración (uso de membranas) 3. Purificación intermedia Precipitación fraccionada Adsorción a membranas 4. Purificación alta resolución Métodos cromatográficos: Intercambio iónico Filtración en gel Afinidad Disolver Liofilizar Formular 5. Conservar

11 ESQUEMA GENERAL DEL AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS POR LA TÉCNICA DE LISIS ALCALINA

12 Aislamiento de plásmidos por el método de lisis alcalina Las bacterias se dejan crecer hasta una fase estacionaria

13 Solución GTE: Glucosa/Tris-HCl/EDTA pH=7.9 La glucosa no tiene carga pero es un osmolito El EDTA une cationes divalentes como Mg 2+ y Ca 2+ en la membrana celular, debilitando la membrana. También el Mg 2+ es cofactor de Dnasas

14 Componentes de la solución GTE Tris-HCl Glucosa

15 Solución de lisis: NaOH 0.2 N / SDS 1% Esta solución disuelve los fosfolípidos y los componentes proteícos de las membranas celulares. SE ROMPE LA MEMBRANA DE LAS CÉLULAS Solución de lisis El NaOH desnaturaliza el DNA plasmídico y cromosomal

16 Acetato de Potasio: Precipita el SDS junto con proteínas y lípidos. El DNA cromosomal que se renaturaliza se atrapa en el precipitado SDS/proteínas/lípidos. Sólo el DNA plasmídico y moléculas de RNA escapan del precipitado y SE ENCUENTRAN EN EL SOBRENADANTE

17 El isopropanol precipita los ácidos nucleícos Incubar por 20 min a -20°C Lavar el botón con etanol al 70%: remueve sales y remanentes de SDS. También remueve el isopropanol. La mezcla isopropanol-etanol se evapora más rápido

18 Purificación de plásmidos Por ejemplo unión al pétido 16mer NH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-His- Gly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-Asn- Gln-COOH

19 ¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de plásmidos? 1.Absorbancia 260 nm 2.Electroforesis en geles de agarosa

20 Por la electroforesis en geles de agarosa se debe monitorear la purificación de plásmidos DNA cromosomal Plásmido abierto Plásmido superenrrollado 1 Precipitación con isopropanol 2 Cromatografía intercambío aniónico 3 Filtración con membrana de nitrocelulosa 4 Lo que se retuvo en la membrana de nitrocelulosa

21 Microscopia de polímero de agarosa

22 Uso de colorantes

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24 Tinción con Syber Safe

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