HEMATOLOGIA 2014 CLASE TEORICO-PRACTICA PRUEBAS PARA EVALUAR EL MECANISMO HEMOSTÁTICO Mariana Raviola.

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1 HEMATOLOGIA 2014 CLASE TEORICO-PRACTICA PRUEBAS PARA EVALUAR EL MECANISMO HEMOSTÁTICO Mariana Raviola

2 HEMOSTASIA Comprende el proceso que previene el sangrado cuando un vaso sanguíneo es dañado y al mismo tiempo mantiene la sangre en estado fluido dentro del árbol vascular

3 HEMOSTASIA FASES: -Respuesta vascular: Vasoconstricción localizada a nivel del área afectada -Hemostasia Primaria: Formación de un agregado o trombo de plaquetas sobre la superficie de vascular lesionada. -Coagulación: Formación de fibrina que refuerza el trombo plaquetario. -Fibrinolisis: Eliminación de los depósitos de fibrina.

4 INDICACIONES PARA EL PACIENTE
Concurrir al laboratorio con ayuno de 8 horas tratando de realizar el menor esfuerzo físico posible

5 FICHA DE ANTECEDENTES DEL PACIENTE
- Motivo de consulta -Trombosis actual o anterior -Gingivorragia, epistaxis, melena, hematuria, hemartrosis -Sangrado post extraccion dentaria -Hemorragia post parto o post cirugia -Menstruacion abundante -Petequias -Antecedentes familiares de trombosis o sangrado. -Consumo de medicamentos: aspirinas, dicumarinicos, heparina, etc

6 HEMOSTASIA PRIMARIA RECUENTO DE PLAQUETAS Anticoagulante: EDTA
Material adecuado: tubos de polipropileno, vidrio siliconado Toma de muestra adecuada: evitar ruptura de tejido

7 HEMOSTASIA PRIMARIA RECUENTO DE PLAQUETAS Métodos manuales
sangre venosa anticoagulada con EDTA Dil. 1/20 con oxalato de amonio 1% (vn: x103/mm3) Contadores hematológicos.

8 Es conveniente observar un frotis de sangre periférica donde
HEMOSTASIA PRIMARIA RECUENTO DE PLAQUETAS Es conveniente observar un frotis de sangre periférica donde se controlará el número, forma y tamaño plaquetario.

9 HEMOSTASIA PRIMARIA Tiempo de sangría Prueba global de la hemostasia primaria. Evalúa interacción: Plaquetas-Pared vascular “in vivo” Depende de: cantidad y calidad funcional de las plaquetas cantidad y calidad funcional de vWF calidad del colágeno. Duke VN < 3 min Ivy VN < 4.5 min Simplate VN < 9.5 min Cohibir cuando tpo > 2 VN

10 Tiempo de sangría TS:  sensibilidad -  especificidad -  reproducibilidad Afectado por: frío, ejercicio, ansiedad, presión del corte, dirección de la incisión, “barrido” excesivo

11 Retracción del Coagulo
HEMOSTASIA PRIMARIA Retracción del Coagulo Se produce a través de la interacción de la GPIIb-IIIa con la actina del citoesqueleto, requiere ATP como fuente de energía, depende de varios factores, calidad y cantidad de plaquetas, cc de fibrinógeno, hematocrito, es poco sensible, y muy influenciada por la limpieza del material

12 RETRACCION DEL COAGULO

13 Retracción del Coagulo
HEMOSTASIA PRIMARIA Retracción del Coagulo Se coloca 1 ml de sangre en tubo de hemolisis de vidrio bien limpio, se mantiene a 37C°,a la hora se observa la magnitud de la retracción. El resultado se expresa en cruces. Cuando el coagulo se ha despegado por completo de la pared del tubo se considera retracción total(+++), cuando no hay retracción es aretráctil, y cuando queda un cuello de fibrina y un sedimento de hematíes se llama fibrinocruorico.

14 HEMOSTASIA PRIMARIA Prueba del Lazo Evalúa fragilidad capilar aplicando una presión positiva que aumenta la presión sanguínea por obstrucción del recorrido venoso. Depende de calidad y cantidad de plaquetas, calidad del vaso y los tejidos adyacentes y del gradiente de presión que tiende a generar la extravasación

15 HEMOSTASIA PRIMARIA Prueba del Lazo Se coloca el esfigmomanómetro en el antebrazo y se deja 5 min. a una presión media entre la máxima y la mínima, se quita la presión y se observa la aparición de petequias luego de unos minutos. VN: Hasta 5 petequias en un circulo de 5 cm de diámetro. Se informa la positividad en cruces

16 HEMOSTASIA PRIMARIA ADHESIVIDAD vW PLAQUETA SUPERFICIE
In Vivo : Borchgrevink (Acta Med Scand 1960, 168:157) In Vitro : Hellem II (superficie de vidrio) Scand J Haemat 1970, 7: 37

17 Adhesividad (%)= 100 *( RT0 – RT2 / RT0 )
HEMOSTASIA PRIMARIA ADHESIVIDAD In Vivo : Borchgrevink Adhesividad (%)= 100 *( RT0 – RT2 / RT0 ) RT0 : recuento de Pq. de muestra de sangre venosa extraída con EDTA RT2 : recuento de Pq. Luego de 2 min de TS. VN: 30-70%

18 ADHESIVIDAD: método de Hellen II
Sangre entera Columna: tubuladura de PVP 3mm diámetro, rellena con perlas de vidrio de 0.5mm diámetro, 1.3 g por columna. Bomba de flujo constante: velocidad 1ml/ 9seg. bomba sp EDTA 2% columna cp %Adh = SP- CP SP VN = %

19 HEMOSTASIA PRIMARIA AGREGACIÓN
La agregación plaquetaria es el resultado final de un complejo proceso metabólico. Cuando el endotelio se daña se exponen una serie de agonistas capaces de activar a las plaquetas, estos son el colágeno de la pared vascular, la trombina generada, la adrenalina y el ADP. La agregacion plaquetaria in vitro se define como la interaccion Pq-Pq medida sobre PRP.

20 Agregación plaquetaria in vitro
IIHEMA - ANM Método óptico (Born, 1980) Método potenciométrico (Challen, 1982)

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22 Condiciones del ensayo:
Sangre obtenida por punción sobre citrato de sodio 3.8% (1:9) Tubos de polipropileno Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP): 10 min a rpm Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP): 15 min a altas rpm. Ajustar concentración del PRP con PPP: 250 – / m3 Tapar tubos para evitar cambios de pH - Realizar el ensayo luego de 30 minutos y hasta 4 hs posteriores a la extracción.

23 AGREGACION Agonistas panel de rutina: ADR: 10 uM ( adrenérgicos)
Col: 1 ug /ml ó 8 ug/ml (GP VI, Ia-IIa) AA: 0.5 mM (receptor de Tx) ADP: 2.5 uM, 5.0 uM (P2Y1, P2Y12) Ristosetina: 1.2 mg/ml (Ib-V-IX), 0.4 mg/ml (vW tipo II) Agonistas especiales TRAP6 : PAR1, PAR4 U46619: análogo de TX Endoperóxidos cíclicos: actividad Tx sintaza Ionóforos (A23187): movilización de Calcio

24 AGREGACION

25 COAGULACIÓN ME TC MI HMWK XII PK XI IX VIII VII X V II I

26 TOMA DE MUESTRA Anticoagulante: Citrato trisodico 3.2 o 3.8 %
No se aconseja utilizar sangre capilar. La sangre venosa debe ser obtenida por punción rápida y precisa, evitando la formación de espuma, el éxtasis venoso y la contaminación con tromboplastina tisular, (torniquete menos de un minuto)

27 TOMA DE MUESTRA La sangre arterial debe ser obtenida por punción directa no traumática. Evitar la extracción por catéter, de ser indispensable, realizar la extracción con doble jeringa y descartar los primeros 5 a 10ml de sangre.

28 TOMA DE MUESTRA No se aconseja la extracción con tubos de vacío, aunque estos tubos pueden utilizarse para colocar la sangre una vez abiertos. Relación ac / sgre, 1+9

29 TOMA DE MUESTRA La relación Anticoagulante / Sangre varía cuando el Hto. se encuentra fuera del rango de 25 – 50%. Para calcular el citrato a utilizar se usa la siguiente fórmula: Sangre entera en ml = 9 x citrato de Na en ml x 0,55 1 – Hto en (v/v)

30 TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS
Cualquiera sea la distancia se remitirán las muestras congeladas, con hielo seco, y en un recipiente adecuado para su conservación, acompañadas de controles normales procesados de igual forma.

31 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
Descartar los tubos que no mantengan adecuada relación ac/ sgre , y aquellos que muestren hemólisis visible. Centrifugar las muestras y separar los plasmas con pipetas de plástico lo mas rápido posible.

32 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
a-Plasma citratado rico en plaquetas (prp) centrifugar 5-10 min. a bajas rpm, separar el plasma y mantener a temperatura ambiente hasta 2 hs b-Plasma citratado pobre en plaquetas (ppp) centrifugar 10 min. a 3000 rpm, utilizar dentro de las 4 hs .

33 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
c- Preparación de pool de plasmas normales Se extrae sangre a como mínimo 10  sujetos normales con básico de coagulación normal , y se prepara ppp se fracciona y se conserva a -80° C hasta 6 meses o solo 1 mes si se guarda a -20 ° C   

34 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
d-Preparación de plasma adsorbido Es plasma desprovisto de los factores vitamina K dependientes, factores II ,VII, IX y X, que quedan adsorbidos en sulfato de bario. A partir de sangre extraída con oxalato de sodio en relación 1+9, se prepara ppp y se mezcla con sulfato de Ba (50 mg por ml de plasma). Se incuba a 37°C 15 min. ,se centrifuga dos veces y se recoge el sobrenadante, que debe tener un TP mayor de 60 seg. El plasma adsorbido posee los factores: I,V,VIII,XI,XII

35 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
e-Preparación de suero Aporta los factores VII, IX, X y un 50% de XI Y XII. Se obtiene dejando coagular la sangre en tubo de vidrio por espacio de 4 hs. Se centrifuga 15 min.  a 3000 rpm .Se puede mantener a 4°C por 24 horas o fraccionar y congelar

36 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
f-Preparación de plasma envejecido Deficitario en factor V, se extrae sangre con oxalato de sodio 0.1 M en proporción 9+1,  se obtiene ppp, y se lo coloca en un enlenmeyer a 37°c. Se controla el decaimiento de la actividad del factor V mediante el TP hasta un valor de 60 seg. Alicuotar y guardar a -20°C

37 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
TPR -Tiempo de plasma recalcificado -Se basa en reiniciar la cadena de activación del sistema de la coagulación al agregar un exceso de iones calcio al plasma citratado y se mide el tiempo que tarda en coagular -Evalúa numero y función de plaquetas Muestra: prp Reactivo: cloruro de calcio 0,025 M

38 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
TPR Procedimiento: incubar unos segundos a 37°C 200 ul de prp y disparar el cronometro al agregar cloruro de calcio 0,025 M, medir en intervalos de 30 seg el tiempo que tarda en coagular Se realiza por duplicado y se informa el promedio VN: 1-3 min. Prolongado: Déficit de factores de la vía intrínseca y del numero y función de las plaquetas.       

39 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
TP -Tiempo de protombina -Mide el tiempo de coagulación de un plasma citratado en presencia de tromboplastina (FT) e iones calcio -Evalúa la vía extrínseca -Se usa para monitorear la terapia con ACO -Refleja cambios en los niveles de los factores II,VII,X,V -En cuanto al fibrinógeno solo una disminución por debajo de 50 mg lo afectan.

40 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
TP Tromboplastina Apoproteina + Fosfolipidos Fuentes: plantas, cerebro de conejo, ratón o mono, recombinarte (humana) a la que se le agregan fosfolipidos naturales o artificiales

41 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
TP Muestra: plasma citratado ppp Reactivo: tomboplastina calcica Procedimiento: incubar 100 ul de ppp 1 min a 37°C, disparar el cronometro al agregar 200 ul de reactivo a 37°C, medir el tiempo de coagulación Los resultados se informan: -En segundos informando entre paréntesis el valor del testigo( 11 recombinante, de conejo) 

42 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
TP -En % de actividad o tasa de trombina: Se preparan diluciones de un pool de plasmas normales y se determina el TP por duplicado, con los datos se grafica una curva, en papel doble log, de TP vs % de actividad, asignando al pool de normales el 100% de actividad. Teniendo el TP del paciente se busca en la curva el % o tasa que le corresponde. VN: %

43 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
TP Valores prolongados se observan en: -Deficiencia congénita o adquirida de uno o varios de los siguientes factores: II,V,VII,X -Hipofibrinogenemia -Enfermedad hepática -Deficiencia de vitamina K -Tratamiento con ACO -Presencia de inhibidores de alguno de los factores involucrados

44 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
APTT -Tiempo de tromboplastina parcial activado -Mide el tiempo que tarda en coagular un plasma citratado ppp en presencia de tromboplastina parcial, un activador, e iones calcio. -Evalúa la vía extrínseca -Se utiliza para controlar la terapia de anticoagulación con heparina

45 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
APTT Tromboplastina parcial: fosfolipidos de la tromboplastina que se obtienen de tejido animal o de fuentes vegetales (cefalina) Activador :- particulado, caolín, celite, sílica micronizada.                -no particulado, ac. Elagico

46 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
APTT Muestra: plasma citratado ppp Reactivos: -cefalina - caolin                  -cloruro de calcio M Procedimiento: incubar100 ul de ppp con 100 ul de rvo a 37°C durante 3 min, disparar el cronometro al agregar 100 ul de cloruro de calcio 0,025 M, medir el tiempo que tarda en coagular. VN: seg.

47 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
APTT Valores prologados se observan en: -Déficit congénito o adquirido de factores II, V, VIII, IX, X, XI, y XII -Tratamiento con heparina -Presencia de inhibidores -Tratamiento ACO instaurado

48 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
TT Evalúa la etapa de fibrinoformación midiendo el tiempo que tarda en coagular el plasma citratado en presencia de trombina, independientemente de las alteraciones que podrían afectar el MI o el ME

49 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
TT Muestra: ppp Reactivo: solución de trombina comercial (liofilizada) o preparada a partir de plasmas de dadores, se ajusta la dilución de manera tal que el testigo sea aproximadamente 15 seg Procedimiento: incubar 100ul de muestra 1 min a 37° C agregar 100 ul de trombina diluida y tomar el tiempo que tarda en coagular.

50 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN
TT Se considera prolongado cuando el plasma del paciente difiere en mas de 4 segundos con el normal. Valores prolongados se observan en : -Niveles bajos de Fibrinógeno o Disfibrinogenemia -Tratamiento con heparina no fraccionada -Presencia de inhibidores adquiridos

51 PRUEBAS ALTERADAS Déficit de factores o presencia de inhibidores?
Mezclas con plasma normal (1+1) corrige no corrige cuantificación de factores detección de inhibidores

52 PRUEBAS DE CORRECCIÓN Para orientarnos sobre las causas que provocan la alteración de las pruebas podemos realizar correcciones mezclando partes iguales del plasma en estudio con: - Plasma adsorbido: aporta los factores I,V,VIII,XI,yXII. -Suero: aporta los factores VII,IX,X,XI, yXII -Plasma envejecido: carece de factor V

53 DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA EXTRINSECA
II, V, VII, X TP plasma patrón/pool de plasma normal(curva de calibración) paciente diluido plasma deficiente en el factor a medir tromboplastina - calcio seg seg pac % pac % factor

54 DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA INTRINSECA
VIII, IX, XI, XII KPTT plasma patrón/pool de plasma normal (curva de calibración) paciente diluido plasma deficiente en el factor a medir cefalina - kaolín Cl2Ca seg seg pac % pac % factor

55 DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA FINAL : FIBRINOGENO (método gravimétrico)
trombina fibrinógeno fibrina -Se recoge el coagulo con varilla de vidrio -Se lava con agua destilada -Se deshidrata con alcohol, y se deja secar a 80° C -Se pesa la fibrina en balanza de precisión, la masa final de fibrina es directamente proporcional a la concentración de fibrinógeno

56 DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA FINAL :FIBRINOGENO
(método de Claus) método básico = TT plasma patrón mg/dl (curva de calibración) paciente trombina seg seg pac mg/dl pac mg/dl

57 SANGRADO SIN ALTERACION DE LA PRUEBAS GLOBALES
Determinación de factor XIII La fibrina formada en ausencia de factor XIII se disuelve en urea 5 M Procedimiento: Se hace coagular 200ul de ppp con 200ul de cloruro de calcio M, y 100 ul de trombina, incubar 30 min a 37°C agregar solución de urea 5 M, desprender el coagulo de las paredes y dejar a temperatura ambiente 24 horas. Observar a los 30min, 1,2,4,y 24 horas la disolución del coagulo Valor normal: no disolución a las 24 horas.

58 FUNCIONES DEL SISTEMA FIBRINOLITICO
ELIMINACIÓN DE LA FIBRINA QUE QUEDA ADHERIDA A LAS PAREDES DE LOS VASOS DESPUÉS DE LA COAGULACION (intravascular) INTERVIENE EN LAS REPARACIONES HÍSTICAS INTERVIENE EN LA ACTIVACION DE LOS MACROFAGOS (extravascular)

59 SISTEMA FIBRINOLÍTICO
Está compuesto por una enzima clave: plasmina (Plm), cuyo precursor inactivo es el plasminógeno ( Plg ). Esta activación puede producirse por : Activador tisular del plasminógeno: t-PA Activador tipo uroquinasa: u-PA Factor XIIa y calicreína

60 SISTEMA FIBRINOLÍTICO
La plasmina produce clivaje tanto del fibrinógeno como de la fibrina. _____________________________________________________ Degradación del fibrinógeno.(Fibrinogenolisis) fragmentos X, Y, D, E ( PDF) Fisiológicamente esto no ocurre ya que las pequeñas cantidades de plasmina que se generan son inhibidas por la antiplasmina. _____________________________________________ Degradación de fibrina. (Fibrinolisis) fragmentos de distinto PM , en su mayoría fragmento D entrecruzado ( D-Dímero) El hallazgo de Dímero D aumentado implica que hubo formación de fibrina entrecruzada y posterior lisis de la misma.

61 EVALUACION DEL MECANISMO FIBRINOLÍTICO
PRUEBAS GLOBALES TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO. TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO DE SANGRE ENTERA DILUIDA. TIEMPO DE LISIS DE EUGLOBULINAS

62 EVALUACION DEL MECANISMO FIBRINOLÍTICO
TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO 2 ml de sangre.Incubar a 37 ºC Tomar el tiempo de lisis. Se informa el tiempo de lisis Normal un tiempo mayor de 24 hs < de 24 hs--- aumento de la act.fibrinolitica < 6hs----asociado a hemorragias. Poco sensible.Sirve en los def. de alfa2-AP

63 EVALUACION DEL MECANISMO FIBRINOLÍTICO
TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO DE SANGRE ENTERA DILUIDA Sangre diluida 1/10 en buffer fosfato y con el agregado de trombina.30 min en heladera Dejar a 37 ºC.Examinar cada 10 min.Anotar tiempo de lisis. Resultado variable. < de 2 hs ---Hiperfribrin. > de 20 hs----Hipofibrinolísis Evaluar junto a la lisis de euglobulinas

64 EVALUACION DEL MECANISMO FIBRINOLÍTICO
LISIS DE EUGLOBULINAS La dilución y acidificación del plasma provoca la precipitación de las euglogulinas( fracción proteica que contiene el fibrinógeno, el plasminógeno, los activadores del plasminógeno y la plasmina), luego se resuspende en buffer alcalino, se coagula y se incuba a 37°C, para registrar el tiempo de lisis del coágulo, este procedimiento elimina los inhibidores de la fibrinolisis.

65 EVALUACION DEL MECANISMO FIBRINOLÍTICO
LISIS DE EUGLOBULINAS El tiempo de lisis del coagulo es inversamente proporcional a la actividad fibrinolítica del plasma

66 EVALUACION DEL MECANISMO FIBRINOLÍTICO
Procedimiento: en tubo de vidrio se agregan 4ml de agua destilada,70ul de acido acético, y 250ul de ppp, se mezcla y deja 30 min a 4° C, se centrifuga 5 min a bajas rpm, en el sobrenadante quedan los inhibidores que se descartan, se deja escurrir y se resuspende con solución de borato de sodio en baño a 37°C hasta disolución y se coagula agregando cloruro de calcio Se registra el tiempo desde la coagulación hasta la disolución total del coagulo.

67 EVALUACION DEL MECANISMO FIBRINOLÍTICO
VN: el coagulo se lisa entre 1h 30 min y 4 hs. Tiempos de lisis inferiores demuestran un aumento de la fifrinolisis a expensas del aumento de los activadores del plasminógeno, pudiéndose asociar con hemorragias. Tiempos de lisis superiores reflejan disminución de la actividad fibrinolítica y pueden asociarse a perdidas embriofetales. La prueba se ve afectada por los niveles de fibrinógeno y de plasminógeno.