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Bqca. Maria Victoria Ivan 2012 Universidad Nacional del Nordeste Hematología Clínica.

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1 Bqca. Maria Victoria Ivan 2012 Universidad Nacional del Nordeste Hematología Clínica

2 Tres fases en el proceso de evaluación total: Pre-analítica*: responsable del 49-73% de los errores en el laboratorio. Analítica: responsable del 7-13% de los errores. Post-analítica: responsable del 13-20% de los errores. 2 INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) 15189: Laboratorios médicos. Requerimientos particulares para calidad y competencia *La fase pre-analítica comienza, en orden cronológico, desde el pedido médico, e incluye la solicitud de exámenes, la preparación del paciente, la recolección de la muestra primaria, y el transporte hacia o dentro del laboratorio y finaliza cuando el proceso de análisis se inicia. Hawkins R, Ann Lab Med, 2012; 32:5-16

3 FASE PRE-ANALÍTICA Limpieza del material SOLUCION DE HIPOCLORITO DE SODIO 1% V/V uso general 2.5% V/V lavado de material de vidrio 10% V/V sangre derramada MEZCLA SULFOCRÓMICA 3

4 FACTORES FISIOLÓGICOS EDAD SEXO EMBARAZO CICLO CIRCADIANO CICLO MENSTRUAL PATOLOGÍA DEL PACIENTE 4

5 PREPARACIÓN DEL PACIENTE* AYUNO: por lo menos 4 h. ESTUDIO DE FIBRINOLISIS: reposo durante 30 minutos y extracción sin torniquete SUEROS TERAPÉUTICOS NO FUMAR 2 H. ANTES EVITAR EJERCICIO INTENSO STRESS MENTAL MEDICAMENTOS: anticonceptivos, terapia hormonal de reemplazo 5 *Blombāck M et al. J Thromb Haemostasis, 2007; 5:855-8.

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7 MATERIAL DE EXTRACCIÓN Tubos de plástico o vidrio siliconado (Lote y fecha de vto.) con tapa celeste (ISO 6710) Agujas Adaptador con aguja Jeringas de material con superficie no activante (ej. polipropileno) de volumen 20 mL 7

8 MATERIAL DE EXTRACCIÓN 8 ¿Cuál aguja usar? Elegir de acuerdo a: Volumen de sangre Edad del sujeto Tamaño de las venas del sujeto IDEAL: Agujas de G (0,8-1,0 mm) *Los resultados de TP y APTT no presentaron diferencias significativas empleando agujas más pequeñas 23G o 25G, aunque si las hubo en el recuento de plaquetas (más bajas) y dímero D (más alto). *Lippi G et al. Blood Coagul Fibrinolysis, 2006; 17(7):

9 Recomendado (CLSI, ISTH y CAHT): Citrato trisódico dihidratado (Na 3 C 6 H 5 O 7 2H 2 O) mM (3,13-3,2%) Aceptable: citrato trisódico dihidratado (Na 3 C 6 H 5 O 7 2H 2 O) 129 mM (3,8%)* Inaceptable: oxalato, heparina, EDTA Proporción volumen sangre/citrato= 9/1 Corregir cuando el Hto >55% (CLSI) ó <25% (CAHT). Vol. Cit.= 1,85 x10 -3 x (100-Hto) x Vol sangre ANTICOAGULANTES 9 *Los tiempos de coagulación tienden a ser más largos con citrato trisódico 3,8%

10 Citrato y mezcla anti-plaquetas: La mezcla bufferada CTAD está compuesta por citrato trisódico/ácido cítrico (0,105 M), teofilina (15 mM), adenosina (3,7 mM) y dipiridamol (0,198 M), con pH 5,32-5,38. Útil en el monitoreo de terapia con heparina mediante APTT y ensayo anti-Xa. Inhibe la función plaquetaria. Citrato e inhibidor de la fibrinólisis: buffer citrato sódico 0,45 M, pH 4,3 con un aditivo citrato fuertemente ácido. Estabiliza el plasma para el análisis de factores fibrinolíticos. Citrato e inhibidor de proteasas: aprotinina, protege al plasma de la acción proteásica antes de realizar las pruebas de coagulación especiales. Con ella se evalúa mejor la concentración de fibrinógeno, pero alarga el APTT. ADITIVOS 10

11 VENOPUNCIÓN 11 Desaconsejado por grupo CAHT

12 Aplicar las precauciones universales de bioseguridad. Realizar la extracción con guantes, por punción directa no traumática. Evitar la extracción de catéter (añadir al informe si se sospecha la presencia de heparina). Se recomienda descartar los primeros 5 mL de sangre o 6 veces el volumen muerto del catéter. 1 er Tubo de descarte: no recomendado por CLSI. Cuando se usa no debe tener aditivos o ser un tubo para coagulación. Se ha comunicado diferencia significativa en el TP/RIN entre los tubos 1 y 2 de recolección.* Torniquete durante menos de 1 minuto con ligadura plana. Una vez extraída y colocada en el tubo la sangre, mezclar por inversión suavemente 3 a 6 veces. Identificar el tubo con la muestra recolectada en presencia del paciente después de la extracción. 12 VENOPUNCIÓN *Tekkeşin N et al. Blood Coagul Fibrinolysis, 2012; 23(4):

13 IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA Nombre completo del paciente Número de identidad único Fecha y hora de la extracción Nombre de la persona que realizó la extracción Tipo de muestra: sangre entera, plasma, anticoagulante usado, suero, etc. Ensayo a realizar (optativo) 13

14 Evitar las temperaturas extremas No transportar las muestras en hielo: activa al FVII, disminuye el FVW y rompe las plaquetas. No debe transcurrir más de 1 hora entre la extracción y el arribo al laboratorio Para el monitoreo de la terapia con heparina, la muestra se debe centrifugar dentro de 1 hora de extraída, aunque si se usa CTAD se puede esperar hasta 4 horas. TRANSPORTE 14

15 Centrifugar los tubos tapados hasta obtener plasma relativamente pobre en plaquetas (plaquetas < 10 x 10 9 /L). Se centrifuga a 1500 g (3000 rpm) por no menos de 15 minutos a temperatura ambiente. Usar la doble centrifugación hasta obtener plasma pobre en plaquetas (plaquetas < 5 x 10 9 /L) para pruebas hemostáticas especiales (anticoagulante lúpico, terapia con heparina). También se puede filtrar el plasma para obtener plasma libre de plaquetas (puede prolongar el TP y APTT). 15 CENTRIFUGACIÓN Azlin I et al. demostraron que una centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos no produjo diferencias significativas en el resultado de TP, APTT y F (Med & Health, 2011; 6(1): ), con respecto a la muestra centrifugada a 3850 rpm durante 15 minutos.

16 CAUSAS DE RECHAZO DE MUESTRAS Muestra coagulada Muestra tomada con anticoagulante incorrecto Relación sangre/anticoagulante inadecuada (tubo sub-llenado o sobrellenado). Se debe recolectar por lo menos el 90% del volumen. Muestra no identificada o mal identificada PRUEBA AFECTADA*LLENADO DEL TUBO APTT89% FIBRINÓGENO78% F VIII67% TP RESISTENCIA A LA PROTEÍNA C ACTIVADA <67% 16 *Lippi G et al. Semin Thromb Hemost, 2012; 38(6): Lai et al informaron un 0,57% de muestras rechazadas (Ann Lab Med, 2012; 32:216-9)

17 INTERFERENCIAS 17 LIPEMIA: no interfieren [TG] < 700 mg/dL ICTERICIA: no interfieren [BIL] < 15 mg/dL HEMÓLISIS: no interfieren [Hb] < 100 mg/dL HEPARINA: no interfiere en TP si es <0,5 U/mL

18 18 ESTABILIDAD DE LA MUESTRA* PRUEBAESTABLE TP24 horas en tubo cerrado sin centrifugar a temp. amb. APTT en pacientes no heparinizados 4 horas en tubo cerrado sin centrifugar a temp. amb. APTT en muestras con heparina no fraccionada 1 hora en tubo cerrado sin centrifugar a temp. amb. Procesar antes de las 4 hs. Anti-Xa, TT, FV, prot. CCentrifugar y procesar antes de las 4 hs. Si las muestras no se procesan a tiempo se separa el plasma y se congela a -20°C (2 semanas) o a -70°C (6 a 24 meses). Para procesarlas se descongela rápidamente en baño a 37°C. *Recomendaciones de CLSI, 2008.

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20 a.Plasma citratado rico en plaquetas (PRP) Centrifugar 5 min. a 900 rpm, separar el plasma y mantener a temperatura ambiente hasta 2 h Función plaquetaria y TPR Procesamiento de la muestra 20

21 b. Plasma citratado pobre en plaquetas (ppp) Centrifugar 10 min. a 3000 rpm, plasma relativamente pobre en plaquetas ( <10.000/ mm 3 ). Utilizar dentro de las 4 horas para estudios prequirúrgicos y control de anticoagulación en pacientes sin antecedentes de sangrado o trombosis 21

22 c. Plasma citratado libre de plaquetas Doble centrifugación de 15 min. a 4500 rpm (<5.000 pq/mm 3 ) permite realizar todos los estudios, se puede fraccionar y congelar junto a un testigo normal. Es el procedimiento ideal para preparar muestras que deben ser derivadas a otros laboratorios para su estudio. 22

23 d. Plasma citratado libre de plaquetas Pasar PPP por un filtro Milipore de 0.22 um de poro, para muestras que deban guardarse a -70°C junto con un testigo normal. Presenta el inconveniente que suele activar las muestras. 23

24 e. Preparación de pool de plasmas normales Se extrae sangre a 10 sujetos normales con básico de coagulación normal y se prepara PPP, se fracciona y se conserva a -80°C hasta 6 meses o solo 1 mes si se guarda a -20°C 24

25 f. Preparación de plasma adsorbido Es plasma desprovisto de los factores vitamina K dependiente (II,VII, IX y X). Se obtiene a partir de sangre anticoagulada con oxalato de sodio 0.1M en relación 1+9. El PPP oxalatado se mezcla con Sulfato de Ba (50 mg por ml de plasma). Se incuba 15 min a 37°C, mezclando por inversión periódicamente, se centrifuga y se recoge el sobrenadante. Se controla haciendo un TP que deberá ser mayor a 60 seg. 25

26 g. Preparación de suero envejecido Aporta los factores VII, IX, X y un 50% de XI y XII. Se obtiene dejando coagular la sangre en tubo seco por espacio de 4 hs. Se centrifuga 15 min a 3000 rpm. Se puede mantener a 4°C por 24 horas o fraccionar y congelar. 26

27 h. Preparación de plasma envejecido Deficitario en factor V y VIII, se extrae sangre con Oxalato de sodio 0.1 M en proporción ac/srge 1+9, se obtiene PPP y se lo incuba a 37°C. Cuando el TP es mayor a 60 segundos se lo fracciona y congela. 27

28 REACTIVOS UTILIZADOS 28 Trazabilidad: Propiedad del resultado de una medición o del valor de un estándar, de poder ser relacionado con referencias establecidas, generalmente patrones nacionales o internacionales, a través de una cadena ininterrumpida de comparaciones, cada una de ellas con sus incertidumbres establecidas. Linealidad Precisión: Concordancia entre medidas repetidas de una muestra.

29 MANTENIMIENTO Y LIMPIEZA DE INSTRUMENTOS 29 Diario Semanal Mensual

30 PRECISIÓN RECOMENDADA 30 *Para las pruebas globales CV<5% usando automatización y CV<10% para técnicas manuales. *Para la determinación de factores por método coagulable CV<10% y para técnicas amidolíticas CV<5%. De acuerdo a la variabilidad biológica la imprecisión máxima tolerable para TP, APTT y F es de 3%, 2% y 8%, respectivamente *Grupo CAHT, Ricos C et al. 2012,

31 COEFICIENTES DE VARIACIÓN DE TP, APTT Y F SEGÚN INSERTO Y OBTENIDOS EN EL LABORATORIO 31 PRUEBA CONTROL NORMAL CONTROL ANORMAL BAJO CONTROL ANORMAL ALTO PROMEDIO TP INSERTO 0,93%1,92% 1,59% TP OBTENIDO* 2,5%1,8%0,9%1,73% APTT INSERTO 1,68%1,72%3,02%2,14% APTT OBTENIDO* 2,6%3,7%3,3%3,2% F INSERTO 5,89%8,0%ND6,94% F OBTENIDO* 5,4%6,3%5,0%5,57% *Instituto de Maternidad y Ginecología Nuestra Señora de las Mercedes, setiembre 2012.

32 Control de Calidad Interno (CCI) 32 Evalúa la precisión de la metodología utilizada. Es decir la concordancia entre medidas repetidas de una muestra. Se utilizan materiales de control y se observa si los resultados obtenidos están dentro de los limites de variación esperados para esas muestras. Puntos a tener en cuenta para realizar un CCI: -Planificar el CCI en base al requerimiento de lo que se va a evaluar Lab. 24 h controlar cada 6 hs (TP, KPTT, TT, FI) Gran cantidad de muestras en batch -manual controlar c/50 muestras -coagulómetros controlar c/100 muestras

33 33 - Seleccionar el material de control adecuado Pool de plasma citratado de 20 donantes normales conservado a - 80°C y descongelado a 37°C Pool de plasma citratado conservado a -20°C para 1 semana Procesar 10 veces, para calcular la media (x) y el desvío estándar (DS o S 2 ) Estos serán los valores de referencia ideales para los controles

34 34 Plasma control liofilizado comercial: Reconstituir con agua destilada (pH ) usar luego de los 30 min. Traen los rangos de aceptabilidad para cada determinación. Incluir un control normal y otro patológico en el rango de interés clínico.

35 35 - Evaluar los resultados del control de calidad Los resultados se evalúan contra el valor ideal previamente establecido (x) y en general se aceptan como validos aquellos que caigan dentro de +/- 2 DS Carta de Control de Calidad *Reglas de Westgard

36 Coeficiente de Variación (CV) Es una medida de la variabilidad de los resultados, se expresa como porcentaje y se calcula teniendo en cuenta X y SD: CV= SD/X Los coeficientes de variación (CV) entre dos controles realizados en días sucesivos deben ser: -Para las pruebas globales < 5% usando automatización y < 10% para técnicas manuales. -Para dosaje de factores por método coagulable < 10% y para técnicas amidolíticas <5%.

37 Control de Calidad Externo 37 Evalúa la habilidad de un laboratorio para obtener un resultado correcto, es decir, evalúa la sensibilidad de la metodología utilizada. Permite compararlo con el desempeño de los pares. Programas de Evaluación Externa de la Calidad para Hemostasia Internacionales: a- United Kindom National External Assesment Schemes ( ) b- College of American Pathologist ( ) Nacionales: a- Subprograma Hemostasia del Programa de Evaluación Externa de la Calidad de la Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires ( )

38 BIBLIOGRAFÍA Adcock D, Hoefner D, Kottke-Marchant K, Marlar R, Szamosi D, Warunek D. Collection, transport and procesing of blood specimens for testing plasma- based coagulation assays and molecular hemostasis assays; approved guidelines- Fifth edition. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2008:28. CLSI Document H21-A5. Adcock D, Hoefner D, Kottke-Marchant K, Marlar R, Szamosi D, Warunek D. Collection, transport and procesing of blood specimens for testing plasma- based coagulation assays and molecular hemostasis assays; approved guidelines- Fifth edition. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2008:28. CLSI Document H21-A5. Grupo CAHT. Fundamentos para el manejo páctico en el laboratorio de hemostasia. Buenos Aires. Primera edición; Grupo CAHT. Fundamentos para el manejo páctico en el laboratorio de hemostasia. Buenos Aires. Primera edición; 2003.


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