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1 Genética molecular Organización, regulación y manipulación genética Dra. Mildred Jiménez.

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1 1 Genética molecular Organización, regulación y manipulación genética Dra. Mildred Jiménez

2 2 Objetivos Comprender las bases moleculares de las mutaciones que conllevan a las enfermedades genéticas Usar tal información para mejorar diagnósticos y tratamientos

3 3 I- Análisis de secuencias individuales de ADN y ARN

4 4 Limitantes iniciales Obtener cantidad suficiente de la secuencia de ADN o ARN de interés a ser analizada. Purificar la secuencia de interés dentro de todos los demás segmentos de ADN o ARNm presentes en la célula. clonaje molecular y PCR

5 5 Clonaje Molecular Involucra la transferencia de una secuencia de ADN de interés a una célula o microorganismo.

6 6 Cultivo del microorganismo Reproducción de la secuencia de ADN introducida + ADN propio Aislamiento de las secuencias de interés en grandes cantidades

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18 18 Enzimas de Restricción 1970s endonucleasa de restricción bacterianas (enzimas de restricción) Reconocen secuencias específicas de la doble banda del ADN y lo cortan cerca o en el sitio de reconocimiento.

19 19 Enzimas de restricción Secuencias de pb Secuencias palindrómicas 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Extremos pegagosos o romos

20 20 EcoRI Reconoce la secuencia específica de 6 pb Corta en cada hebra entre las bases G y A

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24 24 Enzima Origen Bacteriano Sitio de Reconocimiento Resultado del Corte EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC 3'CTTAAG 5'---G**AATTC---3' 3'---CTTAA**G---5' BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5'GGATCC 3'CCTAGG 5'---G**GATCC---3' 3'---CCTAG**G---5' HindIII Haemophilus influenzae 5'AAGCTT 3'TTCGAA 5'---A**AGCTT---3' 3'---TTCGA**A---5' Sau3A Staphylococcus aureus 5'GATC 3'CTAG 5'---**GATC---3' 3'---CTAG**---3' PovII* Proteus vulgaris 5'CAGCTG 3'GTCGAC 5'---CAG**CTG---3' 3'---GTC**GAC---5'

25 25 La digestión de una molécula de ADN con una enzima de restricción determinada colección reproducible y característica de fragmentos de ADN refleja la frecuencia y localización de sitios específicos de restricción

26 26 Implicaciones 1- Un solo cambio de una sola base puede abolir el reconocimiento de la enzima por el sitio y por lo tanto su capacidad de corte en ese determinado lugar 2- Toda las moléculas de ADN digeridas con EcoRI, tienen los mismos extremos pegagosos.

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29 29 Vectores Molécula de ADN que se puede replicar de forma autónoma en un huesped (célula bacteriana o levadura) del cual puede ser aislado de una forma pura para su subsecuente análisis.

30 30 Los vectores pueden alcanzar un alto número de copias por célula. Las bacterias y levaduras se pueden hacer crecer indefinidamente en un laboratorio grandes cantidades del ADN de interés El clonaje de fragmentos humanos de ADN en un vector por medio de enzimas de restricción y AND ligasa, permite la propagación del fragmentos de ADN clonado junto con la molécula del vector.

31 31 ADN recombinante Nueva combinación de ADN creada in vitro entre secuencias de interés de ADN humano (u otro) y moléculas vectoras bacterianas (u otras) capaces de duplicarse indefinidamente dentro de una cepa de laboratorio

32 32 Vectores Plásmidos Bacteriófago Lambda Cósmidos BACs y YACs

33 33 Plásmidos ADN circular doble banda Se replica extracromosomalmente En bacterias o levaduras Resistencia a antibióticos Segmentos cortos de ADN (hasta 15 kb) Selección pocos kb marcadores (resistencia a antibióticos) sitios de restricción

34 34 Bacteriófago Lambda Virus bacterial ADN db relativamente largo (45kb) 1/3 de su genoma es no esencial Infecta las bacterias y se replica en la bacteria produciendo cantidades enormes de virus (hasta 1 millón) Puede crear lisis bacteriana Segmentos de ADN de hasta 20 kb

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36 36 Cósmidos Plásmidos que utilizan la habilidad de las partículas infecciosas del bacteriófago lambda para empaquetar eficientemente piezas lineares de ADN y luego adherirse a la superficie de las bacterias e inyectar el contenido de ADN. Permite segmentos insertos de hasta 45 kb Secuencias Cos

37 37 BACs Bacterial Artificial Chromosomes Plásmidos enormes 1990s Pueden contener insertos de hasta 300 kb

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39 39 YACs Yeast Artificial Chromosomes Vector con mayor capacidad (hasta 2000 kb) Se transfiere a Saccharomyces cerevisiae

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42 42 Librerías Genómicas 1- Digestión parcial del ADN genómico con una enzima de restricción. 2- Digestión del vector (misma ER) 3- Ligación del vector (ADN ligasa) 4- Introducción en célula huesped

43 43 Librerías de ADN complementario Ventajas: Representación directa de las secuencias codificantes (no intrones) Tejidos con expresión selectiva ADNc: copias de la población de ARNm presente en un determinado tejido. Transcriptasa reversa

44 44 Transcriptasa Reversa ADN polimerasa dependiente de ARN Derivada de retrovirus Requiere de primer para iniciar síntesis de ADN (oligo -dT). Oligo dT se une a la cola de poli A de los ARNm Niveles de ARNm transcripto

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47 47 Sondas de Acido Nucleico identificación del clon que lleva la secuencia de interés screening de una librería hibridización del ácido nucleico

48 48 Marcadores (probes) A una secuencia X de ácidos nucleicos se prueba su complementaridad con un fragmento de ADN o ARN conocido y marcado (que se puede detectar). Marcaje: Trazadores radioactivos (Fósforo 32) Compuestos histoquímicos Colorante fluorescente

49 49 acgacttgag

50 50 Hibridación Hebra simple desnaturalización Formación de dobles hebras hibridización a fragmentos de ADN marcados con secuencia nucleótidica equivalente

51 51 II- Reacción en Cadena de la Polimerasa

52 52 PCR Alternativa al clonaje Generar cantidades ilimitadas de una secuencia de interés Es una amplificación enzimática de un fragmento de ADN (blanco o molde) situado entre dos oligonucleótidos primers

53 PCR ADN Primers: le dan la especificidad ADN polimerasa Cofactores enzimáticos A,G,T,C 53

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61 61 Amplificación exponencial 2 n n= # ciclos

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64 64 PCR reverso Amplificación a partir de ARN ARNm ADNc amplificación transcriptasa polimerasa reversa primers…

65 65 Porciones particulares del gen (usualmente exones) se pueden amplificar utilizando primers específicos para el gen normal o el gen mutado. diagnóstico por amplificación diagnóstico por ASO en SB

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67 67 Ventajas del PCR Requiere poca muestra Rápida Barata (inversión inicial!!!) Sensibilidad y especificidad

68 68 III- Métodos para el análisis de ácidos nucleicos

69 69 Southern Blotting Mediados de los 70s Método estándar para analizar la estructura del ADN digerido por enzimas de restricción 1- Aislamiento del ADN 10 ml de sangre => 10 8 leucocitos => 100µg de ADN 2- Digestión => 1 millón de fragmentos 3- Separación de los fragmentos según su tamaño ==> electroforesis en geles de agarosa

70 70 4- Blotting: A) desnaturalización (base fuerte) B) transferencia a un filtro de nitrocelulosa (blotting), por corriente eléctrica 5- Unión con una sonda marcada ==> hidridación 6- Lavados 7- Revelado (exposición al revelador, placa de rayos X…)

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74 74 Electroforesis en geles de agarosa Separa las moléculas por tamaño Fragmentos pequeños migran más rapidamente que los grandes Tinción con bromuro de etidio ==> Fluoresce con luz UV

75 75 NEGATIVOPOSITIVO

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77 77 Análisis con sondas alelo específicas Sonda sintética de oligonucleótidos = ASO (Allele Specific Oligonucleotide) Corta longitud aprox. 20 pb ===> sensible a diferencias en un par de bases ASOs para el alelo normal o para el alelo mutado Permite diferenciar homocigotas y heterocigotas

78 78 Porciones particulares del gen (usualmente exones) se pueden amplificar utilizando primers específicos para el gen normal o el gen mutado. diagnóstico por amplificación diagnóstico por ASO en SB

79 79 Thompson & Thompson Genetics in Medicine

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81 81 IV- Métodos para análisis de proteínas

82 82 Western Blotting 1- Aislamiento de las proteínas de la muestra 2- Separación por electroforesis en geles de poliacrilamida 3- Transferencia a membrana 4- Incubación de la membrana con Ac anti -proteína en cuestión 5- Adición de un segundo Ac marcado 6- Revelado

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84 84 V- Análisis de la secuencia de ADN

85 85 Secuenciación de Sanger Análogos de nucleótidos que inhiben la polimerasa Materiales: ADN molde a secuenciar Primers ADN polimerasa dNTPs ddNTPs análogos marcados (fluorescencia o radiación) Electroforesis en gel de agarosa

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91 91 VI- Hibridación in situ de cromosomas

92 92 FISH (hibridación fluorescente in situ ) Cromosomas en metafase se fijan en portaobjetos Se desnaturalizan in situ ==> se exponen las dos hebras del ADN Se hibridizan con sondas marcadas con un colorante fluorescente Se visualizan al microscopio de fluorescencia con una longitud de onda que y un filtro para observar el fluorocromo

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94 94 Chromosome painting Parte de un brazo cromosómico Todo un brazo El cromosoma entero Spectral karyotiping (SKY) Análisis de telómeros / microdeleciones

95 95 Mapeo por FISH Permite visualización directa de la posición del gen Regiones de 1-2 millones de pb (cromatina condensada)

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98 98 Un caso interesante de transferencia de genes se ilustra en este experimento en el que aisló el gen para la enzima luciferasa de las luciérnagas y se incorporó en esta planta.

99 99 Literatura: Nelson D, Cox M. Lehninger Principles in Biochemistry. Strachan T, Read A. Human Molecular Genetics Nussbaum R, McInnes R, Willard H. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. Bases de datos:


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