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TECNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR. ENDONUCLEASAS O ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Generan cortes internos en la molécula de ADN Generan cortes internos en la molécula.

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1 TECNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

2 ENDONUCLEASAS O ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Generan cortes internos en la molécula de ADN Generan cortes internos en la molécula de ADN Pueden generar extremos romos o cohesivos Pueden generar extremos romos o cohesivos

3 Enzimas de Restricción

4 Extremos cohesivos

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6 Extremos romos

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8 Clonación y uso de enzimas

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11 Separación de fragmentos Geles de Agarosa Geles de Agarosa Geles de poliacrilamida Geles de poliacrilamida

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13 CLONACIÓN

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15 PCR ( reacción en cadena de polimerasa) Componentes de la reacción Polimerasa Polimerasa Primers Primers dNTPs dNTPs Cloruro de magnesio Cloruro de magnesio Agua Agua Buffer Buffer

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29 SOUTHERN BLOT

30 1) Blood sample. 2) DNA is extracted from blood cells. 3) DNA is cut into fragments by a restriction enzyme. 4) The DNA fragments are separated into bands during electrophoresis in an agarose gel. 5) The DNA band pattern in the gel is transferred to a nylon membrane. 6) Radioactive DNA probe, designed to recognise specific DNA sequences, is prepared. 7) Probe DNA binds to the specific DNA sequences on the membrane. 8) Excess DNA is washed off, but the DNA pattern is invisible at this stage. 9) X-ray film is placed next to the membrane & exposed to the radioactive DNA. 10) The developed X-ray shows the pattern of DNA bands

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36 SECUENCIACIÓN

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44 VNTR

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49 DNA fingerprinting in Argentina to establish kinship of the 'disappeared', the children, often born in captivity, of parents kidnapped and assassinated by the former military regime there. Here a geneticist uses a multi-channel pipette to prepare samples for the process. A bank of blood samples, taken from all the potential relatives, provides the DNA for comparison with that from the child in question. Fragments of DNA are seperated into bands by electrophoresis in an agarose gel. Every human being produces a unique pattern of DNA bands, hence its potential as a kind of genetic

50 CLONACIÓN EN ANIMALES

51 COPY-CAT (EE.UU 2002)

52 PAMPA (Argentina 2002)

53 PROMETEA (Italia 2003)

54 Ian Wilmut and Dolly. In 1996, British embryologist Professor Ian Wilmut created, the world's first sheep cloned from an adult sheep cell. The research was conducted at the Roslin Institute in Edinburgh, Scotland.

55 Marcadores moleculares Y sus aplicaciones

56 Tipos de Marcadores Directos o sea dentro del gen (intragénicos) Directos o sea dentro del gen (intragénicos) Indirectos usando a otro gen o marcador cercano en el cromosoma para poder identificar sus diferencias entre individuos Indirectos usando a otro gen o marcador cercano en el cromosoma para poder identificar sus diferencias entre individuos

57 RFLPs Pueden hacerse por Southern blot Pueden hacerse por Southern blot Pueden hacerse por PCR Pueden hacerse por PCR

58 Utilidad Detección de individuos portadores de un gen recesivo. Detección de individuos portadores de un gen recesivo. Test de paternidad o trazabilidad. Test de paternidad o trazabilidad. Selección asistida por marcadores, Selección asistida por marcadores, Salud publica, Salud publica, Virología, etc Virología, etc

59 Por Southern blot

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61 Por PCR y luego restricción

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63 VNTRs o microsatélites Pueden hacerse por Southern blot Pueden hacerse por Southern blot Por PCR y geles de poliacrilamida o agarosa Por PCR y geles de poliacrilamida o agarosa Por SSCP Por SSCP

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71 Cepas diferentes de Salmonellas

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